Name: economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 e TJWJ202021QN034).

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Nanchino.
1. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM
<ol><li>Sacrificare topi C57BL/6 (18-22 g, 6-8 settimane) tramite asfissia di CO2 . Fissare il mouse sul tavolo operatorio del mouse. Disinfettare le superfici con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Tagliare la pelle della gamba per esporre i muscoli e l'arteria femorale. Blocca e stra...

<ol>
	<li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses.">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li><li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo.">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity.">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity.">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells.">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer.">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786 (2021).</li><li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+ontogeny:+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin.">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited:+both+CD8alpha(-)+and+CD8alpha(+)+dendritic+cells+are+generated+from+CD4(low)+lymphoid-committed+precursors.">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions.">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).</li><li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow:+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor.">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li><li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures.">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li><li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells.">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li><li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus.">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li><li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA.">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li><li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate:+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study.">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).</li><li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage.">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li><li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma.">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li></ol>

Gli esseri umani e i topi hanno diversi sottoinsiemi dc, tra cui DC classici (cDC, inclusi cDC1 e cDC2s), DC plasmacitoidi (pDC) e DC derivati da monociti (MoDC)9,10,11. È generalmente accettato che i cDC1 regolano le risposte dei linfociti T citotossici (CTL) ai patogeni intracellulari e al cancro e i cDC2 regolano le risposte immunitarie a patogeni extracellulari, parassiti e allergeni12. Un numero sig...

Le cellule dendritiche (DC) sono le più potenti cellule che presentano l'antigene (APC) per attivare le cellule T naïve e indurre risposte specifiche dei linfociti T citotossici (CTL) contro malattie infettive, malattie allergiche e cellule tumorali 1,2,3. Le DC sono il collegamento primario tra immunità innata e immunità adattativa e svolgono un ruolo essenziale nella difesa immunologica e nel mantenimento della tolleranza immunitaria. Negli ultimi 40 anni, molti ricercatori hanno cercato di definire i sottoinsiemi di DC e le loro funzioni nell'infiammazione e nell'immunità. Secondo questi studi, le DC si sviluppano lungo le linee mieloidi e linfoidi dalle cellule del midollo osseo. I vaccini contro i tumori hanno raggiunto traguardi significativi negli ultimi anni e hanno un futuro promettente. Meccanicamente, i vaccini tumorali modulano la risposta immunitaria e prevengono la crescita tumorale attivando i linfociti T citotossici utilizzando antigeni tumorali. Il vaccino a base di DC svolge un ruolo importante nell'immunoterapia tumorale ed è stato identificato come una delle terapie antitumorali più promettenti 1,4. Inoltre, i DC sono stati ampiamente utilizzati nella sperimentazione di nuovi farmaci a bersaglio molecolare e inibitori del checkpoint immunitario5.
I ricercatori hanno urgente bisogno di un numero elevato di DC ad alta purezza per studiare ulteriormente il ruolo dei DC. Tuttavia, le DC sono rare in vari tessuti e sangue, rappresentando solo l'1% delle cellule del sangue negli esseri umani e negli animali. La coltura in vitro di cellule dendritiche del midollo osseo (BMDC) è un metodo importante per ottenere grandi quantità di cellule DC. Nel frattempo, il protocollo Lutz per la generazione di DC dal midollo osseo è stato ampiamente utilizzato dai ricercatori6. Sebbene il protocollo sia efficace nell'ottenere cellule DC, è complesso e costoso, comportando l'aggiunta di alte concentrazioni di citochine e la lisi dei globuli rossi.
In questo studio, riportiamo un metodo per isolare quasi tutte le cellule del midollo osseo dal midollo osseo di topo (BM) e indurre la differenziazione in BMDC dopo 7-9 giorni di incubazione in vitro, con una concentrazione inferiore di GM-CSF e IL-4. Questa procedura richiede solo 10 minuti per raccogliere quasi tutte le cellule del midollo osseo e per sospenderle in un mezzo completo. In breve, forniamo un metodo di coltivazione efficiente ed economico per BMDC in questa ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-MHC II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percp/cy5.5-CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRMI-1640</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse GM-CSF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>156603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice

La domanda di cellule dendritiche (DC) sta gradualmente aumentando con l'avanzare della ricerca immunologica. Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale per isolare le DC prevede principalmente l'induzione della differenziazione del midollo osseo (BM) nelle DC iniettando grandi dosi (>10 ng / mL) di fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi / interleuchina-4 (GM-CSF / IL-4), rendendo la procedura complessa e costosa. In questo protocollo, utilizzando tutte le cellule BM coltivate in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4, dopo 3-4 scambi di semicoltura, sono state raccolte fino a 2,7 x 107 cellule CD11c+ (DC) per topo (due femori) con una purezza dell'80%-95%. Dopo 10 giorni in coltura, l'espressione di CD11c, CD80 e MHC II è aumentata, mentre il numero di cellule è diminuito. Il numero di cellule ha raggiunto il picco dopo 7 giorni di coltura. Inoltre, questo metodo ha richiesto solo 10 minuti per raccogliere tutte le cellule del midollo osseo e un numero elevato di DC è stato ottenuto dopo 1 settimana di coltura.

Le cellule 1 x 10 7-1,7 x 107 sono state estratte da due femori e sono state nuovamente sospese in 24 ml di terreno prima di essere piantate in una piastra a 6 pozzetti (Figura 1A). Dopo 2 giorni, le cellule non aderenti sono state rimosse cambiando completamente il terreno di coltura. Prima di cambiare il mezzo, è stato osservato un numero significativo di cellule sospese (Figura 1B). Dopo 3 giorni di coltura, iniziarono a formarsi coloni...

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Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dal topo. Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institution Animal Ethics Committee dell'Università di Medicina di Nanchino.One.Introduzione. Con l'aumento della ricerca sull'immunità tumorale, la domanda di cellule DC sta gradualmente aumentando.Tuttavia, le DC sono rare in tutti i tessuti. Il metodo tradizionale di indurre principalmente la differenziazione del midollo osseo in DC è complicato e costoso. Due. Isolamento del midollo osseo e preparazione delle cellule BM Sacrifichiamo i topi e fissiamo sul tavolo operatorio del topo.Tagliare la pelle dei muscoli esposti a sinistra e dell'arteria femorale. Non tagliare direttamente l'arteria femorale. Altrimenti, causerà forti emorragie e contaminerà il campo visivo.Taglia tutti i muscoli intorno al femore. Allungare lentamente gli arti inferiori del topo verso l'esterno fino al prolasso della testa del femore e può essere osservato. Separare gli arti inferiori dal corpo.Tagliare la zampa posteriore per ottenere un femore libero e completo. Rimuovere i muscoli usando una garza. Non strappare direttamente i muscoli.Il femore dei topi è fragile. Mettere il femore al 75% di alcol per due o cinque minuti. Tre. Coltura per iniezione di BMDC Risciacquare l'alcol residuo con PBS.Blocca la parte centrale e inferiore del femore con una pinza emostatica e blocca l'estremità inferiore del femore con un'altra pinza emostatica. Le pinze emostatiche vengono applicate letteralmente al femore e il femore viene rotto dalla linea epifisaria. Utilizzare una siringa da un ml per perforare la cavità del midollo osseo dalla linea epifisaria.Utilizzare mezzo completo due parti lavare la cavità del midollo osseo fino a quando l'osso diventa bianco. Raccogliere fluidi di lavaggio. Integrando il mezzo completo contenente GM CSF / IL-4 a 24 ml e seme in un piatto a 6 pozzetti con 4 ml per pozzetto. Four.Risultati.Dopo due giorni, sostituire tutti i mezzi contenenti GM-CSF/IL-4. Metà ha sostituito il mezzo completo contenente GM-CSF/IL-4, il quarto, il sesto e l'ottavo giorno. Il numero di cellule ha raggiunto un picco il settimo giorno e poi è diminuito gradualmente.Le cellule DC hanno formato un gran numero di sinapsi mostrando una tipica morfologia di cellule DC mature. Le analisi submetriche di flusso mostrano che il rapporto di CD11c ha imposto ciò che il 71% il sesto giorno, l'ampio rapporto aumenta al 96,1% il 10 ° giorno. L'espressione di CD11c, CD80 e MSC2, è aumentata gradualmente con l'aumentare del tempo di coltivazione. Cinque.Conclusione.In breve, abbiamo stabilito un protocollo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo dai topi, che richiede solo 10 minuti per separare le cellule del midollo osseo. Un numero elevato di DC ad alta purezza è stato raccolto dopo sei-sette giorni di coltura con 10ng per ml, GM-CSF e IL-4.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

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Un modello di topo In Vivo di attivazione delle cellule T Naïve CD4 di misura, la proliferazione e la differenziazione Th1 indotta dalle cellule dendritiche derivate da midollo osseo

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

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Nuovo protocollo per la generazione di cellule dendritiche fisiologiche immunogene

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