Name: economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice
Uploaded: 2022-07-01T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice at JoVE.com

Эта работа была поддержана Программой Тяньцзиньского научно-технического плана (20JCQNJC00550), Тяньцзиньским научно-техническим проектом здравоохранения (TJWJ202021QN033 и TJWJ202021QN034).

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Нанкинского медицинского университета.
1. Выделение костного мозга и подготовка БМ-клеток
<ol><li>Жертвоприношение мышей C57BL/6 (18-22 г, 6-8 недель) через удушьеCO2 . Зафиксируйте мышь на опера?...

<ol>
	<li>Huang, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen-loaded+monocyte+administration+induces+potent+therapeutic+antitumor+T+cell+responses.">Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).</li><li>Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+loading+of+CTL+epitopes+onto+MHC+class+I+complexes+on+dendritic+cell+surface+in+vivo.">Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo.</a> Biomaterials. 182, 92-103 (2018).</li><li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity.">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li><li>Jiang, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Galactosylated+liposome+as+a+dendritic+cell-targeted+mucosal+vaccine+for+inducing+protective+anti-tumor+immunity.">Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity.</a> Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).</li><li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+immunotherapies+to+improve+anticancer+immunity.">Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+advanced+culture+method+for+generating+large+quantities+of+highly+pure+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow.">An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow.</a> Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).</li><li>Son, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+bulk-culture+method+for+generating+mature+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cells.">A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells.</a> Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).</li><li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+protein+vaccine+based+on+Ag85B+and+STEAP1+induces+a+protective+immune+response+against+prostate+cancer.">Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer.</a> Vaccines. 9 (7), 786 (2021).</li><li>Olweus, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell+ontogeny:+A+human+dendritic+cell+lineage+of+myeloid+origin.">Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concept+of+lymphoid+versus+myeloid+dendritic+cell+lineages+revisited:+both+CD8alpha(-)+and+CD8alpha(+)+dendritic+cells+are+generated+from+CD4(low)+lymphoid-committed+precursors.">Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors.</a> Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).</li><li>Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+human+and+mouse+dendritic+cell+development+and+function.">Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function.</a> Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).</li><li>Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+evolutionary+conservation+of+dendritic+cell+subset+identity+and+functions.">Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions.</a> Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).</li><li>Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow:+in+vitro+differentiation+using+low+doses+of+recombinant+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor.">Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.</a> Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).</li><li>Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+murine+dendritic+cells+from+flt3-ligand-supplemented+bone+marrow+cultures.">Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures.</a> Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).</li><li>Mayordomo, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=marrow-derived+dendritic+cells+pulsed+with+synthetic+tumour+peptides+elicit+protective+and+therapeutic+antitumour+immunity.">marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity.</a> Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).</li><li>Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-based+immunization+by+in+vivo+transfection+of+dendritic+cells.">DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells.</a> Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).</li><li>Brunner, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-prandial+administration+of+the+insulin+analogue+insulin+aspart+in+patients+with+type+1+diabetes+mellitus.">Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus.</a> Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).</li><li>Koido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+antitumor+immunity+by+vaccination+of+dendritic+cells+transfected+with+MUC1+RNA.">Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA.</a> Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).</li><li>Jonasson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strength+of+the+porcine+proximal+femoral+epiphyseal+plate:+The+effect+of+different+loading+directions+and+the+role+of+the+perichondrial+fibrocartilaginous+complex+and+epiphyseal+tubercle+-+An+experimental+biomechanical+study.">Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study.</a> Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).</li><li>Labeur, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+tumor+immunity+by+bone+marrow-derived+dendritic+cells+correlates+with+dendritic+cell+maturation+stage.">Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage.</a> Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).</li><li>Hinkel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+dendritic+cells+generated+from+nonfractionated+bulk+peripheral+blood+mononuclear+cell+cultures+induce+growth+of+cytotoxic+T+cells+against+renal+cell+carcinoma.">Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).</li></ol>

Люди и мыши имеют различные подмножества постоянного тока, включая классические ДК (кДК, включая cDC1s и cDC2s), плазмоцитоидные ДК (pDC) и моноцитарные ДК (MoDC)9,10,11. Общепризнано, что cDC1s регулируют цитотоксические ответы Т-лимфоцитов (CTL) на внут...

Дендритные клетки (DC) являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками (APC) для активации наивных Т-клеток и индуцирования специфических цитотоксических реакций Т-лимфоцитов (CTL) против инфекционных заболеваний, аллергических заболеваний и опухолевых клеток 1,2,3. ДК являются основным связующим звеном между врожденным иммунитетом и адаптивным иммунитетом и играют важную роль в иммунологической защите и поддержании иммунной толерантности. За последние 40 лет многие исследователи стремились определить подмножества ДК и их функции при воспалении и иммунитете. Согласно этим исследованиям, ДК развиваются вдоль миелоидных и лимфоидных линий из клеток костного мозга. Опухолевые вакцины приобрели значительные вехи в последние годы и имеют многообещающее будущее. Механически опухолевые вакцины модулируют иммунный ответ и предотвращают рост опухоли, активируя цитотоксические Т-лимфоциты с использованием опухолевых антигенов. Вакцина на основе ДК играет важную роль в иммунотерапии опухолей и была идентифицирована как одна из наиболее перспективных противоопухолевых терапий 1,4. Кроме того, ДК широко используются при тестировании новых молекулярно-целевых препаратов и ингибиторов иммунных контрольных точек5.
Исследователям срочно необходимо большое количество РС высокой чистоты для дальнейшего изучения роли РС. Тем не менее, ДК редко встречаются в различных тканях и крови, составляя только 1% клеток крови у людей и животных. Культура in vitro дендритных клеток костного мозга (BMDC) является важным методом получения большого количества клеток DC. Между тем, протокол Лутца для генерации ДК из костного мозга широко используется исследователями6. Хотя протокол эффективен в получении клеток постоянного тока, он является сложным и дорогостоящим, предполагающим добавление высоких концентраций цитокинов и лизис эритроцитов.
В этом исследовании мы сообщаем о методе выделения почти всех клеток костного мозга из костного мозга мыши (BM) и индуцирования дифференцировки в BMDC после 7-9 дней инкубации in vitro с более низкой концентрацией GM-CSF и IL-4. Эта процедура занимает всего 10 минут, чтобы собрать почти все клетки костного мозга и приостановить их в полной среде. Короче говоря, мы предоставляем эффективный и экономичный метод культивирования для BMDC в этом исследовании.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>M8211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-MHC II</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-CD80</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percp/cy5.5-CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRMI-1640</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse GM-CSF</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-4</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P00196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>156603</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

economical and efficient protocol for isolating and culturing bone marrow-derived dendritic cells from mice

Спрос на дендритные клетки (ДК) постепенно увеличивается по мере продвижения иммунологических исследований. Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод выделения ДК в первую очередь включает индуцирование дифференцировки костного мозга (БМ) в ДК путем введения больших доз (>10 нг/мл) гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора/интерлейкина-4 (GM-CSF/IL-4), что делает процедуру сложной и дорогостоящей. В этом протоколе, используя все BM-клетки, культивируемые в среде 10 нг/мл GM-CSF/IL-4, после 3-4 полукультурных обменов, было собрано до 2,7 x 107 клеток CD11c+ (DC) на мышь (две бедренные кости) с чистотой 80%-95%. После 10 дней в культуре экспрессия CD11c, CD80 и MHC II увеличилась, тогда как количество клеток уменьшилось. Количество клеток достигло пика после 7 дней культивирования. Более того, этот метод занял всего 10 минут, чтобы собрать все клетки костного мозга, и большое количество ДК было получено после 1 недели культивирования.

Клетки 1 x 10 7-1,7 x 107 были извлечены из двух бедренных костей и повторно суспендированы в 24 мл среды, прежде чем их посадили в 6-луночную пластину (рисунок 1A). Через 2 дня неадгезивные клетки удаляли путем полного изменения питательной среды. Перед изменением сред?...

Watch this Scientific Journal Video about Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice at JoVE.com

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

Здесь мы представляем экономичный и эффективный метод выделения и генерации дендритных клеток высокой чистоты костного мозга у мышей после 7 дней культивирования с 10 нг / мл GM-CSF / IL-4.

Экономичный и эффективный протокол для выделения и культивирования дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...

Экономичный и эффективный протокол выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мыши. Процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетом по этике животных Института Нанкинского медицинского университета. С увеличением исследования опухолевого иммунитета спрос на клетки ПОСТОЯННОГО тока постепенно увеличивается.Тем не менее, DC редко встречаются во всех тканях. Традиционный метод в основном индуцирования дифференцировки костного мозга в РС является сложным и дорогостоящим. Два. Выделение костного мозга и получение БМ-клеток Мы жертвуем мышами и фиксируем на мышином операционном столе.Разрезают кожу левой обнаженной мышцы и бедренной артерии. Не перерезайте бедренную артерию напрямую. В противном случае это вызовет сильное кровотечение и загрязнит поле зрения.Обрежьте все мышцы вокруг бедренной кости. Медленно растягивайте нижние конечности мыши наружу до выпадения головки бедренной кости и может наблюдаться. Отделите нижние конечности от тела.Отрежьте заднюю ногу, чтобы получить свободную и полную бедренную кость. Удалите мышцы с помощью марли. Не разрывайте мышцы напрямую.Бедренная кость мышей хрупкая. Поместите бедренную кость в 75% спирт на две-пять минут. Три. Инъекционную культуру BMDC промыть остаточным спиртом PBS.Зажмите среднюю и нижнюю часть бедренной кости кровоостанавливающими щипцами, а нижний конец бедренной кости другим гемостатическими щипцами. Кровоостанавливающие щипцы наносятся буквально на бедренную кость, а бедренная кость отрывается от эпифизарной линии. Используйте один мл шприца для прокалывания полости костного мозга от эпифизарной линии.Используйте полную среду двумя частями промывки полости костного мозга до тех пор, пока кость не станет белой. Собирайте промывочные жидкости. Дополняют полную среду, содержащую ГМ CSF/IL-4 до 24 мл, и высевают в 6-луночную пластину с 4 мл на лунку. Четыре.Результаты.Через два дня замените все среды, содержащие GM-CSF/IL-4. Половина заменила полную среду, содержащую GM-CSF/IL-4, на четвертый, шестой и восьмой день. Количество клеток достигло пика на седьмой день, а затем постепенно уменьшалось.Клетки DC образовали большое количество синапсов, демонстрирующих типичную зрелую морфологию клеток DC. Субметрические анализы потока показывают, что соотношение CD11c наложило то, что 71% на шестой день, широкое соотношение увеличилось до 96,1% на 10-й день. Экспрессия CD11c, CD80 и MSC2 постепенно увеличивалась с увеличением времени культивирования. Пять.Заключение.Короче говоря, мы создали экономичный и эффективный протокол для выделения и генерации дендритных клеток, полученных из костного мозга, у мышей, который занимает всего 10 минут для разделения клеток костного мозга. Большое количество ДК высокой чистоты было собрано после шести-семи дней культивирования с 10 нг на мл, GM-CSF и IL-4.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Оптимизированный протокол для эффективной трансфекции дендритных клеток без сотового Созревание

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Генерация и маркировки костного мозга мышей-дендритных клеток с Qdot нанокристаллов для отслеживания исследований

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer's Patches

Изоляция и Иммуноокрашивание лимфоциты и дендритные клетки из мышиных Патчи Пейера

Peyer's  patches (PPs) are integral components of the gut-associated lymphoid tissues  (GALT) and play a central role in intestinal immunosurveillance and ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Костного мозга, полученных макрофагов производства

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Выделение и внутривенное введение мышиных костного мозга моноцитов

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Эффективное протокол Изоляция для B и Т-лимфоциты из небных миндалин человека

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Флуоресценция активированных сортировки клеток для очистки плазмоцитов дендритных клеток из костного мозга мыши

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

В естественных условиях модель мыши для активации Т-клеток CD4 наивно мера, пролиферации и дифференцирования Th1, индуцированных дендритные клетки костного мозга, полученных

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Novel Protocol for Generating Physiologic Immunogenic Dendritic Cells

Новый протокол для генерации физиологических иммуногенных дендритных клеток

Extracorporeal photochemotherapy (ECP) is a widely used cancer immunotherapy for cutaneous T cell lymphoma (CTCL), operative in over 350 university ...