Name: isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments
Uploaded: 2021-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institutes of Health tilskud HL119798, HL095070 og HL139757 til HJ. HJ støttes også af Wallace H. Coulter Distinguished Faculty Chair Professorship. Tjenesterne fra Emory Integrated Genomics Core (EIGC) blev subsidieret af Emory University School of Medicine og blev også delvist støttet af Georgia Clinical and Translational Science Alliance fra National Institutes of Health under tildelingsnr. UL1TR002378. Indholdet ovenfor er udelukkende forfatternes ansvar og afspejler ikke de officielle synspunkter fra National Institutes of Health.

Alle dyreforsøg beskrevet nedenfor blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Emory University. Ikke-hyperkolesterolemiske, alders- og kønsmatchede C57BL/6-mus blev brugt til at afbøde kønsafhængig variation og opveje enhver komplikation af hyperkolesterolemiske tilstande.
1. Delvis carotisligation (PCL) kirurgi
BEMÆRK: Delvis halspulsåreligation af LCA blev udført som tidligere beskrevet og demonstreret3.
<ol>...

<ol>
	<li>Kumar, S., Kang, D. W., Rezvan, A., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+atherosclerosis+development+in+C57Bl6+mice+by+overexpressing+AAV-mediated+PCSK9+and+partial+carotid+ligation.">Accelerated atherosclerosis development in C57Bl6 mice by overexpressing AAV-mediated PCSK9 and partial carotid ligation.</a> Laboratory Investigation. 97 (8), 935-945 (2017).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+carotid+ligation+is+a+model+of+acutely+induced+disturbed+flow,+leading+to+rapid+endothelial+dysfunction+and+atherosclerosis.">Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulation Physiology. 297 (4), 1535-1543 (2009).</li><li>Nam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+disturbed+flow-induced+atherosclerosis+in+mouse+carotid+artery+by+partial+ligation+and+a+simple+method+of+RNA+isolation+from+carotid+endothelium.">A model of disturbed flow-induced atherosclerosis in mouse carotid artery by partial ligation and a simple method of RNA isolation from carotid endothelium.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e1861 (2010).</li><li>Dunn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+epigenetic+DNA+methylation+regulates+endothelial+gene+expression+and+atherosclerosis.">Flow-dependent epigenetic DNA methylation regulates endothelial gene expression and atherosclerosis.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 3187-3199 (2014).</li><li>Kumar, S., Kim, C. W., Son, D. J., Ni, C. W., Jo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-dependent+regulation+of+genome-wide+mRNA+and+microRNA+expression+in+endothelial+cells+in+vivo.">Flow-dependent regulation of genome-wide mRNA and microRNA expression in endothelial cells in vivo.</a> Scientific Data. 1 (1), 140039 (2014).</li><li>Ni, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+mechanosensitive+genes+in+vivo+using+mouse+carotid+artery+endothelium+exposed+to+disturbed+flow.">Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.</a> Blood. 116 (15), 66-73 (2010).</li><li>Son, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atypical+mechanosensitive+microRNA-712+derived+from+pre-ribosomal+RNA+induces+endothelial+inflammation+and+atherosclerosis.">The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis.</a> Nature Communications. 4, 3000 (2013).</li><li>Andueza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+reprogramming+by+disturbed+flow+revealed+by+single-cell+RNA+and+chromatin+accessibility+study.">Endothelial reprogramming by disturbed flow revealed by single-cell RNA and chromatin accessibility study.</a> Cell Reports. 33 (11), 108491 (2020).</li><li>Stuart, T., Srivastava, A., Lareau, C., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+single-cell+chromatin+analysis+with+Signac.">Multimodal single-cell chromatin analysis with Signac.</a> bioRxiv. , (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+integration+of+single-cell+data.">Comprehensive integration of single-cell data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Crowley, L. C., Marfell, B. J., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+cell+death+by+trypan+blue+uptake+and+light+microscopy.">Measuring cell death by trypan blue uptake and light microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (7), (2016).</li><li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA-seq+reveals+cellular+heterogeneity+of+mouse+carotid+artery+under+disturbed+flow.">Single-cell RNA-seq reveals cellular heterogeneity of mouse carotid artery under disturbed flow.</a> Cell Death and Discovery. 7 (1), 180 (2021).</li><li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activated+cell+populations+using+single-cell+RNA-seq.">Detecting activated cell populations using single-cell RNA-seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li><li>O'Flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+RNA-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses.">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell RNA-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biology. 20 (1), 210 (2019).</li></ol>

Dette papir giver en detaljeret protokol til isolering af enkeltcellepræparater fra musens halspulsårer. Indflydelsen af d-flow på endotelcellerne kan undersøges nøjagtigt, hvis PCL-operationen udføres korrekt. Det er afgørende at korrekt identificere grene af den fælles carotis, såsom den ydre carotis, indre carotis, occipital arterie og overlegen skjoldbruskkirtelarterie. Validering af strømningsmønstre ved ultrasonografi validerer yderligere den vellykkede begyndelse af d-flowforhold . Sel...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally
to:
Sandeep Kumar*1 
Aitor Andueza*1 
Nicolas Villa-Roel1 
Juyoung Kim1 
Dong-Won Kang1 
Hanjoong Jo1,2 
1Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 2Division of Cardiology, Georgia Institute of Technology and Emory University 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63128">Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments</a>. The Authors section was&#160;updated.

Erratum: Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-cell Multi-omics Experiments

Dette laboratorium har tidligere vist, at induktion af d-flow fører til hurtig og robust ateroskleroseudvikling hos hyperlipidæmiske mus 1,2. Den nye musemodel af d-flow-induceret åreforkalkning var mulig ved hjælp af delvis carotisligation (PCL) kirurgi 3. PCL-kirurgi inducerer lav og oscillerende blodgennemstrømningstilstand eller d-flow i den ligerede venstre halspulsåre (LCA). I modsætning hertil fortsætter den kontralaterale højre halspulsåre (RCA) med stabil laminær strømning (s-flow). Tidligere, for at forstå effekten af d-flow på endotelceller, blev halspulsårerne dissekeret efter delvis ligeringskirurgi og skyllet med et phenol- og guanidinisothiocyanatbaseret lyseringsmiddel (luminal RNA / DNA-skyllemetode)2,4, som gav endotelberigede "pooled bulk" RNA'er eller DNA'er. Disse samlede bulk-RNA'er eller DNA'er blev derefter behandlet til transkriptomiske undersøgelser eller epigenomiske DNA-methylomundersøgelser, henholdsvis 4,5,6. Disse undersøgelser hjalp med at opdage flere flowfølsomme gener og mikroRNA'er, hvis roller i endotelbiologi og aterosklerose blev grundigt undersøgt 4,6,7.
På trods af endotelberigelse kunne disse bulk RNA / DNA-undersøgelser imidlertid ikke skelne mellem hver celletypes specifikke rolle i arterievæggen i d-flow-induceret aterosklerose. Endotelberiget enkeltcelle (sc) isolation og scRNA- og scATAC-sekventeringsstudier blev udført for at overvinde denne begrænsning8. Til dette blev C57Bl6-mus udsat for PCL-operationen for at inducere d-flow i LCA, mens de brugte den s-flow-eksponerede RCA som kontrol. To dage eller to uger efter PCL-operationen blev musene ofret, og carotiderne blev dissekeret og ryddet op. Lumen fra både LCA'er og RCA'er blev infunderet med collagenase, og de luminale collagenasefordøjelser indeholdende EC'er som en signifikant fraktion og andre arterielle celler blev opsamlet. Enkeltcellesuspensionen (scRNAseq) eller enkeltkernesuspensionen (scATACseq) blev forberedt og stregkodet med unikke identifikatorer for hver celle eller kerne ved hjælp af en 10x Genomics-opsætning. RNA'erne blev udsat for cDNA-biblioteksforberedelse og sekventeret.
ScRNAseq- og scATACseq-datasættene blev behandlet ved hjælp af Cell Ranger Single-Cell-softwaren og yderligere analyseret af Seurat- og Signac R-pakkerne 9,10. Hver celle og kerne blev tildelt en celletype fra disse analyser og grupperet i celletypen baseret på markørgener og unikke genekspressionsmønstre. Resultaterne af scRNAseq og scATACseq viste, at disse enkeltcellepræparater er beriget med EC'er og også indeholder glatte muskelceller (SMC'er), fibroblaster og immunceller.
Yderligere analyse viste, at EF-populationen i luminalfordøjelsen er meget divergerende og plastisk (8 forskellige EC-klynger) og lydhør over for blodgennemstrømning. Vigtigst af alt viste disse resultater, at d-flow omprogrammerer EC'er fra en atherobeskyttet antiinflammatorisk fænotype til pro-atherogene fænotyper, herunder proinflammatorisk, endotel-til-mesenkymal overgang, endotelstamme / stamcelleovergang og mest overraskende endotel-til-immuncellelignende overgang. Derudover afslører scATACseq-data nye flowafhængige kromatintilgængelighedsændringer og transkriptionsfaktorbindingssteder på en genom-dækkende måde, som danner grundlag for flere nye hypoteser. Metoden og protokollen til fremstilling af enkeltendotelceller til enkeltcellede multi-omics-undersøgelser fra musens halspulsårer er beskrevet nedenfor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals, Peptides, and Recombinant Proteins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (Cell Culture Grade)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21040CMX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Protein LoBind Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022-43-108-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Centrifuge Tube - Foam Rack, Sterile</td>
			<td>Fablab</td>
			<td>FL4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL SuperClear Centrifuge Tubes</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>3191-335-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Silk Suture Sterile</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>s-1172 c2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m Cell Strainer, White, Sterile, Individually Packaged</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase solution,sterile-filtered</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Buffer (Component I of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATAC Enzyme (Component II of Transposition Mix)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>2000123/ 2000138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Med-Vet International</td>
			<td>RXBUPRENOR5-V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Controller &#38; Next GEM Accessory Kit</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell 3&#39; Reagent Kits v3.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromium Next GEM Single Cell ATAC Reagent Kits v1.1</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>1000175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2100502.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D141-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Forceps</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase1</td>
			<td>New England Biolabs Inc</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge (Benchtop-Model # 5425)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620444230VR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum - Premium Select</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed Angle Rotor</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>FA-45-24-11-Kit Rotor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>51558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe (3/10 mL 29 G syringe)</td>
			<td>BD</td>
			<td>305932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Patterson vet</td>
			<td>789 313 89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACs Smart Strainers (30 &#181;m)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS SmartStrainers (100 &#181;m)</td>
			<td>&#160;Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-098-463</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Saline (0.9% sodium chloride)</td>
			<td>Baxter International Inc</td>
			<td>2B1323</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei Buffer (20x)</td>
			<td>10x Genomics</td>
			<td>PN 2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x), pH 7.4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientic</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co</td>
			<td>RS-5675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5480</td>
			<td>or similar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mend II</td>
			<td>Webster Veteinanry</td>
			<td>07-856-7946</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type II Collagenase</td>
			<td>MP biomedicals</td>
			<td>2100502.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deposited Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scATACseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scRNAseq FastQ files</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject Accession # PRJNA646233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Algorithms</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger 3.1.0</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>https://support.10xgenomics.com/ single-cell-gene-exp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cicero</td>
			<td>Pliner et al., 2018</td>
			<td>https://cole-trapnell-lab.github.io/cicero-release/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ggplot2 v3.2.1</td>
			<td>Hadley Wickham</td>
			<td>https://cran.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Harmony</td>
			<td>Korsunsky et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/immunogenomics/harmony</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>Schneider et al., 2012</td>
			<td>https://imagej.nih.gov</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocle 2.8.0</td>
			<td>Qiu et al., 2017</td>
			<td>https://github.com/cole-trapnell-lab/ monocle-release</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.6.2</td>
			<td>R Foundation</td>
			<td>https://www.r-project.org</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat 3.1.3</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/satijalab/seurat</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Signac 0.2.5</td>
			<td>Stuart et al., 2019</td>
			<td>https://github.com/timoast/signac</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of endothelial cells from the lumen of mouse carotid arteries for single-cell multi-omics experiments

Aterosklerose er en inflammatorisk sygdom i arterielle regioner udsat for forstyrret blodgennemstrømning (d-flow). D-flow regulerer ekspressionen af gener i endotelet på de transkriptomiske og epigenomiske niveauer, hvilket resulterer i proatherogene reaktioner. For nylig blev enkeltcellede RNA-sekventering (scRNAseq) og enkeltcelleassay for transposase tilgængelig kromatinsekventering (scATACseq) undersøgelser udført for at bestemme de transkriptomiske og kromatintilgængelighedsændringer ved en enkeltcelleopløsning ved hjælp af musens partielle carotisligation (PCL) model. Da endotelceller (EC'er) repræsenterer en mindre brøkdel af de samlede cellepopulationer i arterievæggen, blev der anvendt en luminal fordøjelsesmetode til at opnå EC-berigede enkeltcellepræparater. Til denne undersøgelse blev mus udsat for PCL-kirurgi for at inducere d-flow i venstre halspulsåre (LCA), mens de brugte højre halspulsåre (RCA) som kontrol. Halspulsårerne blev dissekeret to dage eller to uger efter PCL-operationen. Lumen i hver carotis blev udsat for kollagenasefordøjelse, og endotelberigede enkeltceller eller enkeltkerner blev opnået. Disse enkeltcellede og enkeltkernepræparater blev efterfølgende stregkodet ved hjælp af en 10x Genomics mikrofluidisk opsætning. De stregkodede enkeltceller og enkeltkerner blev derefter brugt til RNA-forberedelse, biblioteksgenerering og sekventering på en DNA-sequencer med høj kapacitet. Efter bioinformatikbehandling identificerede scRNAseq- og scATACseq-datasættene forskellige celletyper fra luminalfordøjelsen, primært bestående af EC'er. Glatte muskelceller, fibroblaster og immunceller var også til stede. Denne EC-berigelsesmetode hjalp med at forstå virkningen af blodgennemstrømning på endotelet, hvilket kunne have været vanskeligt med den samlede arteriefordøjelsesmetode. Den EC-berigede enkeltcellepræparationsmetode kan anvendes til at udføre enkeltcellede omics-undersøgelser i EC-knockouts og transgene mus, hvor virkningen af blodgennemstrømning på disse gener ikke er undersøgt. Det er vigtigt, at denne teknik kan tilpasses til at isolere EC-berigede enkeltceller fra humane arterieeksplanter til at udføre lignende mekanistiske undersøgelser.

Delvise carotis-ligationsoperationer blev udført på 44 mus, og begyndelsen af d-flow i LCA blev valideret ved at udføre ultralyd en dag efter delvis ligeringsoperation. Vellykket delvis ligeringskirurgi forårsager nedsat blodgennemstrømningshastighed og vender blodgennemstrømningen (forstyrret flow) i LCA3. Halspulsårerne blev dissekeret enten to dage eller to uger efter ligering. Lumen i hver carotis blev udsat for kollagenasefordøjelse, og endotelberigede enkeltceller eller enke...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments at JoVE.com

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Vi præsenterer en metode til isolering af endotelceller og kerner fra lumen i musens halspulsårer udsat for stabile eller forstyrrede strømningsforhold for at udføre enkeltcelle omics-eksperimenter.

Isolering af endotelceller fra lumen i musens halspulsårer til enkeltcellede multi-omics-eksperimenter

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

I et blodkar er antallet af endotelceller meget lavt, hvilket gør det vanskeligt at studere dem. Vores protokol eliminerer denne begrænsning og giver os mulighed for at studere nye molekylære veje og terapi. Vores protokol giver os mulighed for at opnå endotelberigede prøver og studere, hvordan akut og kronisk forstyrret strømning påvirker denne celletype.Evnen til at studere endotelceller mere detaljeret gør det muligt at definere målgener og derfor potentielle terapier til aterosklerose rettet mod endotelceller. Carotisarterieisolering er vanskelig og kræver tålmodighed og erfaring. Til at begynde med skal du forberede dyret ved at injicere 0,05 milligram pr. Kg buprenorphin subkutant.Steriliser det epilerede område ved hjælp af Betadin og isopropanolopløsning tre gange. Lav et ventralt midterlinjesnit på cirka en centimeter i nakkeområdet. Udsæt derefter LCA-grenpunktet ved stump dissektion.Læg den venstre indre carotis, ekstern carotis og occipital arterier med 6-0 suturer, hvilket efterlader den overlegne skjoldbruskkirtelarterie uberørt. Luk snittet med vævslim eller suturer. Overfør musen til et forvarmet genopretningsbur, der holdes ved 37 grader Celsius.Placer musen på et rent håndklæde i op til en time for at undgå hypotermi efter operationen. Indsæt en 21 gauge nål i IV-linjen, der er forbundet via hjertets spids i venstre ventrikel. Tillad retrograd perfusion i to til tre minutter ved hjælp af normal saltvand ved stuetemperatur.Oprethold en konstant strømningshastighed ved at anvende konstant tryk, mens du injicerer eller bruger en IV-linje, og hold saltvandsposen i en højde på otte til ni fod. Fjern huden fra nakkeområdet med alt fedt, muskler og bindevæv for at udsætte halspulsårerne. Fjern derefter periadventitialvævene omkring carotiderne, så carotis er fastgjort til kroppen.Lav et snit under ligeringsstedet i LCA for at tillade perfusion. Perfuse LCA gennem venstre ventrikel i endnu et minut for at fjerne eventuelle blodspor. Vask ydersiden af halspulsårerne med normal saltopløsning for at fjerne spor af blod.Brug en insulinsprøjte med en 29 gauge nål til at injicere 50 mikroliter fordøjelsesbuffer i lumen i den distale ende af venstre halspulsåre. Brug et mikroklip til at klemme den proksimale ende af halspulsåren fyldt med fordøjelsesbuffer. Tilsæt 15 til 20 mikroliter fordøjelsesbuffer i lumen, og klip den distale ende for at undgå frigivelse af fordøjelsesbuffer.Overfør halspulsårerne fra musen til 35 millimeter skåle, der indeholder varm 37 grader Celsius HEPES bufferet saltopløsning. Og inkuber dem i 45 minutter ved 37 grader Celsius med intermitterende rocking. Fjern halspulsåren med klemmerne fra 35 millimeterskålen, efter at den luminale enzymatiske fordøjelse er afsluttet.Fjern klemmerne forsigtigt, så fordøjelsesbufferen ikke lækker. Hold den ene ende af halspulsåren oven på et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tilsæt 100 mikroliter varm fordøjelsesbuffer til lumen ved at indsætte en 29 gauge nål udstyret med en insulinsprøjte.Skyl hurtigt lumen i halspulsåren i mikrocentrifugerøret, og tilsæt derefter 0,3 mikroliter FBS i røret for at stoppe reaktionen. Placer mikrocentrifugerøret på is. Centrifuger cellerne ved 500 G i fem minutter ved fire grader Celsius ved hjælp af en centrifuge udstyret med en rotor med fast vinkel og kassér supernatanten.Suspender cellerne i fordøjelsesbufferen, der indeholder celledissociationsreagens, og inkuberer dem i fem minutter ved 37 grader Celsius for at adskille dem i enkeltceller. Bloker den enzymatiske reaktion ved at tilsætte 0,15 ml FBS til 0,5 milliliter røret, og gentag centrifugeringen. Supernatanten kasseres, og cellerne gensuspenderes i 100 mikroliter iskold 1% BSA-opløsning i PBS i et 0,2 ml mikrocentrifugerør.Til enkeltcelleanalyse skal pelleten resuspenderes med 100 mikroliter iskold 1% BSA i PBS i et 0,2 milliliter rør. Til analyse af enkeltkernen resuspenderes cellepelleten i 100 mikroliter 0,04% BSA i iskold PBS og centrifugeres enkeltcellesuspensionen ved 500G ved fire grader Celsius i fem minutter. Nedbrydning af enkeltcellesuspensionen med iskold lysisbuffer, og inkuberes i fem minutter på is.Bland lysatet med en P20-pipette, og inkuber i yderligere 10 minutter. Overfør derefter lysatet i et 0,5 milliliter rør. Vask lycellerne med 500 mikroliter buffer, og bland dem med en pipette.Gentag derefter centrifugeringen. Supernatanten kasseres, og kernepelleten gensuspenderes i 150 mikroliter af den fortyndede kernebuffer. Tæl de enkelte kernepræparater ved hjælp af et hæmocytometer.Efter enkeltkernesekventeringsundersøgelsen blev enkeltcelle- og enkeltkerner opnået og visualiseret ved lysfelt- og fasekontrastmikroskopi. Effektiviteten af enkeltkernepræparatet fra enkeltcellesuspensionen blev også demonstreret. Efter enkeltcelle-RNA-sekventeringsundersøgelsen blev der opnået forskellige parametre såsom fordeling af gener pr. Celle, unik molekylær identifikator pr. Celle, mitokondrielæsninger pr. Celle og sekventeringsmætningsdata.For enkeltcelle ATAC-sekvensstudiet blev indsatsstørrelsesfordelingen, herunder nukleosombåndmønsteret, observeret. Den normaliserede TSS-berigelsesscore blev også observeret. Derudover læser procentfragmentet i toppe.Peak region fragmenter, TSS berigelse score, forholdet mellem læsninger i sortlisten genomiske steder, og nukleosom signal ratio blev bestemt. Den enzymatiske fordøjelse er en belastning for cellerne, derfor er det afgørende at vedligeholde prøverne på is og udføre proceduren så hurtigt som muligt. Vi kan bruge denne metode til at opnå og plade endotelceller fra mus.Vi kan også bruge denne teknik til at udføre bulk Omix-baserede undersøgelser. Denne teknik banede vejen for at studere effekten af forstyrret blodgennemstrømning på endotelceller in vivo på en enkelt celle måde.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generering af mus afledt fra induceret pluripotente stamceller

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolering af microvaskulæreendothelial Tubes fra Mouse modstandskar

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolering af murint Ventil endotelceller

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

Isolering og primær kultur af muse aortaendotelceller

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Isolering af Mouse koronar endotelceller

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Isolering og karakterisering af musens primære lever sinusformede endotelceller

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Isolering af betinget udødeliggjorte museglomerulære endotelceller med fluorescerende mitokondrier

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...