Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Tak til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres indsats, ekspertise og rådgivning i at bidrage til de præsenterede eksperimenter. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH-tilskud til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

De institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved Yale University og University of Virginia godkendte alle dyreforsøg, der er anført i denne protokol.
1. Få museøjne til retinal isolering
<ol><li>Forbered 1x iskold PBS og tilsæt 500 μL til hver brønd på en 48-brøndsplade.</li>
	<li>Afliv neonatale mus på postnatal dag seks (P6) i henhold til godkendte institutionelle retningslinjer. Til dette forsøg aflives kuld på ca. 4-8 neonatale mus ved P6 via isoflur...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Denne protokol beskriver en metode til isolering af endotelceller fra postnatal murin retinal væv, der er optimeret til højt celleantal, renhed og levedygtighed. Cellerenhed opnås ved FACS-isolering af endotelcellepopulationer fra den fordøjede enkeltcellesuspension ved CD31+/CD45- immunostaining. Kvaliteten af isolering kvantificeres i assays for levedygtighed ved trypanblåfarvning og genekspression ved qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selvom VE-Cadherin ikke blev anvendt til immunostaining). De kritiske trin i ...

Den høje kapacitetskapacitet af sekventering af nukleinsyrer via næste generations sekventeringsmetoder har i høj grad avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi. Disse avancerede teknikker omfatter hele transkriptom RNA-sekventering, DNA-sekventering af målrettede regioner til identifikation af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP'er), DNA-sekventering af bundne transkriptionsfaktorer i kromatinimmunoprecipitation (ChIP) sekventering eller åbne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering1 . I vaskulær biologi har disse fremskridt gjort det muligt for forskere at belyse komplicerede udviklings- og sygdomsmekanismer sammen med at skelne genekspressionsmønstre langs et kontinuum af forskellige fænotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan yderligere definere komplekse mekanismer ved at kombinere næste generations sekventering med evaluerede modeller for vaskulær udvikling, men metoderne til prøveforberedelse skal være kompatible med de avancerede sekventeringsteknikker.
Kvaliteten, nøjagtigheden og reproducerbarheden af næste generations sekventeringsmetoder afhænger af metoden til prøveforberedelse. Ved isolering af en delmængde af celler eller generering af enkeltcellesuspensioner fra væv er optimale fordøjelses- og oprensningsmetoder afgørende for at maksimere celleantal, levedygtighed og renhed af cellepopulationen 4,5. Dette kræver en balance i fordøjelsesmetoden: stærk fordøjelse er nødvendig for at frigive celler fra vævet og opnå nok celler til nedstrøms tilgange, men cellelevedygtigheden vil blive negativt påvirket, hvis fordøjelsen er for stærk 6,7. Derudover er renheden af cellepopulationen nødvendig for robuste resultater og nøjagtig analyse af data, som kan opnås gennem FACS. Dette fremhæver vigtigheden af at optimere celleisoleringsmetoder til at anvende næste generations sekventering på etablerede modeller for vaskulær udvikling.
En velkarakteriseret model til undersøgelse af vaskulær udvikling er murine retinal vaskulær udviklingsmodel. Murine retinal vaskulatur udvikler sig postnatalt i en todimensionel overfladisk plexus, med indledende angiogen spiring fra synsnerven synlig ved postnatal dag (P)3, angiogen front med stilk- og spidsceller og indledende karmodning synlig ved P6 og modning af vaskulær plexus synlig efter P9 8,9. Under ombygningen af den indledende vaskulære plexus gennemgår endotelceller specifikation mod arterielle, kapillære og venøse fænotyper i forskellige kar for at generere et kredsløbsnetværk10,11. Derfor giver denne metode forskere mulighed for at visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelarteriel-venøs specifikation og modning på forskellige tidspunkter under udvikling9. Derudover giver denne model en metode til at undersøge virkningerne af transgen manipulation på angiogenese og vaskulær plexusudvikling, som er blevet anvendt til undersøgelse af vaskulær udvikling, arterielle-venøse misdannelser og oxygeninduceret neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For at kombinere næste generations sekventeringsmetoder med murine retinal vaskulær udviklingsmodel er en optimeret protokol til isolering af endotelceller fra retinalt væv nødvendig.
Denne protokol beskriver en optimeret metode til fordøjelse af retinalt væv fra mus ved P6 for at maksimere celleudbytte, renhed og levedygtighed. Retinalt væv isoleres fra P6-mus, fordøjes i 20 minutter, immunfarves til CD31 og CD45 og renses gennem FACS for at isolere en enkeltcellesuspension af endotelceller på ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelceller viste sig at opretholde høj levedygtighed i 60 minutter efter isolering17, hvilket gjorde det muligt at forberede biblioteket til næste generations sekventeringsmetoder. Derudover leveres repræsentative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrolresultater fra to separate næste generations sekventeringsmetoder ved hjælp af denne isolationsprotokol: hele transkriptom-RNA-sekventering og enkeltcellet RNA-sekventering. Denne metode gør det muligt at anvende næste generations sekventeringsmetoder sammen med den retinale vaskulariseringsmodel for at belyse nye mekanismer for vaskulær udvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Nylige forbedringer i næste generations sekventering har avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi, hvor flere undersøgelser afslører nye paradigmer inden for vaskulær biologi. Anvendelse af disse metoder til modeller for vaskulær udvikling kræver optimering af celleisoleringsteknikker fra embryonale og postnatale væv. Celleudbytte, levedygtighed og renhed skal alle være maksimale for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater fra næste generations sekventeringsmetoder. Den neonatale mus retinale vaskulariseringsmodel bruges af forskere til at studere mekanismer for vaskulær udvikling. Forskere har brugt denne model til at undersøge mekanismer for angiogenese og arteriel-venøs skæbnespecifikation under dannelse og modning af blodkar. Anvendelse af næste generations sekventeringsteknikker til at studere den retinale vaskulære udviklingsmodel kræver optimering af en metode til isolering af retinale endotelceller, der maksimerer celleudbytte, levedygtighed og renhed. Denne protokol beskriver en metode til murine retinal vævsisolering, fordøjelse og oprensning ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Resultaterne indikerer, at den FACS-oprensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulation er stærkt beriget til endotelcellegenekspression og udviser ingen ændring i levedygtighed i 60 minutter efter FACS. Inkluderet er repræsentative resultater af næste generations sekventeringsmetoder på endotelceller isoleret ved hjælp af denne metode, herunder bulk RNA-sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering, hvilket viser, at denne metode til retinal endotelcelleisolering er kompatibel med næste generations sekventeringsapplikationer. Denne metode til retinal endotelcelleisolering vil give mulighed for avancerede sekventeringsteknikker til at afsløre nye mekanismer for vaskulær udvikling.

Fordøjelse af retinalt væv og immunostaining for CD31 og CD45 resulterer i en identificerbar population af CD31 + / CD45- endotelceller efter gating for celler, enkeltceller og levedygtighed (figur 2A). CD45 immunostaining er nødvendig for at eliminere CD31 + / CD45+ celler, som omfatter blodplader og nogle leukocytter21. Der bør udføres kontroller for hvert forsøg for at vise antistofspecificitet og vejledende strategi (figur 2B). ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Denne protokol beskriver en metode til isolering af murine postnatal retinale endotelceller optimeret til celleudbytte, renhed og levedygtighed. Disse celler er velegnede til næste generations sekventeringsmetoder.

Isolering af murine retinale endotelceller til næste generations sekventering

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Denne metode til retinal endotelcelleisolering vil give mulighed for avancerede sekventeringsteknikker til at afsløre nye mekanismer for vaskulær udvikling. Den beskrevne protokol er optimeret til høje grader af levedygtighed og renhed, som er afgørende for næste generations sekventeringsapplikationer. Shelby Cain, en kandidatstuderende fra Hershey Laboratory, demonstrerer proceduren.Begynd at fjerne øjnene fra den aflivede neonatale mus ved at skære huden og membranen væk over øjet med et vinkelret snit til øjenlåget ved hjælp af dissektionssaks. Brug derefter tangen til at trykke ned over og under øjet, så øjet bevæger sig ud af stikkontakten. Klem forsigtigt under øjet med tangen og skær synsnerven, der holder øjet fastgjort.Placer derefter begge øjne fra musen i en brønd af 48-brøndspladen i den frisklavede iskolde PBS, indtil høsten er færdig. For at isolere musens nethindevæv skal du suspendere øjnene i dissektionspuden i en petriskål fyldt med 500 mikroliter iskold PBS ved hjælp af en overførselsrørpude med en bred spids. Arbejd under dissektionsmikroskopet, hold synsnerven med en fin tang og brug den anden tang til at gennembore hullet gennem øjets forreste kammer, hvor hornhinden og sclera forbinder.Riv derefter hullet i en cirkel omkring 75% af vejen rundt om hornhinden. Mens du holder synsnerven med en tang, skal du bruge den anden tang til forsigtigt at rive sclera og glaslegemet af nethinden. For at fjerne linse- og hyaloid plexusbeholdere skal du nå ind i nethinden med åben tang, indtil du næsten rører ved den, og derefter lukke tangen for at gribe og trække linse- og hyaloid plexusbeholderne ud af nethinden.Når alle beholdere er fjernet, anbringes nethinden i de to milliliter mikrocentrifugerør fyldt med 500 mikroliter af en x iskold PBS. Fjern overskydende PBS fra to milliliter mikrocentrifugerøret med en pipette, der efterlader ca. 100 mikroliter PBS i røret for helt at dække nethindevævet. Tilsæt derefter 500 mikroliter af den frisklavede fordøjelsesopløsning til røret.Brug en P1000 pipetta og pipettespids til at pipettere op og ned i nethindevævet i fordøjelsesopløsningen fem gange. Når du er færdig, inkuberes fordøjelsesblandingen i et 37 grader Celsius vandbad i 20 minutter med pipettering af fordøjelsesblandingen op og ned hvert femte minut som forklaret før. Efter inkubation opløses retinalvævet i en enkeltcellesuspension, der gør fordøjelsesblandingen uklar.Derefter pellets cellerne ved centrifugering ved 375 g i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter centrifugering fjernes PBS fra den vaskede cellepellet ved pipettering og immunstainer derefter cellerne ved at resumere pelleten i 100 mikroliter antistoffarvningsopløsning pr. 0,5 gange 10 til de sjette celler. Inkuber enkeltcellesuspensionen med antistoffarvningsopløsningen i 30 minutter på is i mørke med at banke røret hvert 10. minut for forsigtigt at blande cellerne.Til fluorescensaktiveret cellesortering pelleteres cellerne ved centrifugering ved 375 g i fem minutter ved fire grader Celsius. Efter fjernelse af supernatanten vaskes og pellets cellerne i 500 mikroliter PBS som beskrevet før. Og suspenderer derefter cellerne i 300 mikroliter fluorescensaktiveret cellesortering eller FACS-buffer ved forsigtigt at blande med pipettaen.Derefter tilsættes propidiumiodid eller PI som en levedygtighedsmarkør til prøverørene indeholdende FACS-bufferen for at få en endelig koncentration på 0,5 mikrogram pr. Milliliter. Brug en pipette til at overføre cellesuspensionerne gennem en cellesi-snaphætte indeholdende et 35 mikron filter til et fem milliliter reagensglas. Efter filtrering skal du holde FACS-røret på is i mørke og derefter overføre røret til cellesortereren.Tænd for FACS-instrumentet og computeren, og åbn FACS-softwaren for at køre og betjene FACS-instrumentet. Udfør rutinemæssige kvalitetskontroltest. Læg kontrolpletprøverne i FACS-instrumentet for at justere akserne.Start med IgG-antistofceller kun for at generere og justere fremadgående spredning og sidespredning. Derefter CD31 antistof kun for at generere og justere CD31. Og derefter CD45-antistof kun for at generere og justere CD45.Registrer dataene fra kontroleksemplerne. Derefter indlæses de farvede prøveceller i FACS-instrumentet, og prøven køres. Gang cellerne baseret på forward scatter eller FSC og side scatter eller SSC parametre.Gangceller fra FSCA og FSCH til at identificere celledubletter og kun indsamle enkeltceller. Gangceller af PI og SSCA for at identificere levedygtige celler. Lav en CD31+CD45-gangart med kontrolelementer Lav en CD31+CD45-gangart med kontrolelementer, og gang cellerne efter CD31 og CD45.Indsæt et opsamlingsrør med 250 mikroliter FACS-buffer i instrumentet. Begynd derefter at sortere celler, der er CD31 + CD45-i det installerede opsamlingsrør. Opbevar opsamlingsrørene på is for yderligere analyse.Prøverne kan behandles til næste generations sekventeringsapplikationer. I undersøgelsen påvirkede varierende fordøjelsestid celleudbyttet og levedygtighedsprocenten. Fordøjelsestiden på 20 minutter resulterede i et optimalt udbytte med en lav procentdel af ikke-levedygtige endotelceller.Efterfølgende propidiumiodidfarvning viste, at de isolerede endotelceller forblev levedygtige i 60 minutter efter isolering. Cellepopulationsrenhed blev vurderet ved kvantitativ PCR- eller qPCRR-analyse af ekspressionen af endotelcellegener, der viste stærk berigelse for endotelcellegener i CD31+CD45-populationen. Rensning af RNA fra de isolerede endotelceller, der konverterer og forstærker cDNA gennem biblioteksforberedelse og sekventering cDNA-biblioteket resulterede i mere end 16.000 gener identificeret i ni uafhængige prøver.Et fald i transkripter pr. Million læsninger eller TPM blev observeret i gener under denne tærskel. Den enkeltcellede RNA-sekventering af de isolerede retinale endotelceller gennem 10x Genomics-rørledningen resulterede i en median på 1.171 gener pr. Celle, 15.247 samlede gener detekteret og en median på 2.255 unikke molekylære identifikator- eller UMI-tal pr. Celle i 917 celler. De kritiske trin i denne protokol er retinal vævsisolering og vævsfordøjelse, som skal udføres nøjagtigt som beskrevet for at optimere celleudbyttet og levedygtigheden.De isolerede endotelceller kan anvendes i avancerede sekventeringsteknikker såsom hel-transkriptom RNA-sekventering, enkeltcelle RNA-sekventering, kromatinimmunoprecipitationssekventering og assay til transposase-tilgængelig kromatinsekventering. Brugen af denne optimerede metode i kombination med næste generations sekventeringsmetoder og ved beregningsmetoder kan yderligere belyse mekanismerne for sammenkoblede signalveje, der regulerer vaskulær udvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Udledning af retinale pigmentepitel Celler fra stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Dermal Fibroblast Isolation ved FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolation i Endothelial stamceller fra menneskelige navlestrengsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hurtig, instrueret differentiering af retinale Pigment epitel celler fra menneskelige embryonale eller induceret pluripotente stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation af Somite derivater fra menneskelige induceret celler pluripotente stamceller

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplexed enkelt celle mRNA sekvensering analyse af mus embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Forberedelse af små RNA-biblioteker til sekventering fra tidlige museembryoner

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolering af endokardie- og koronarenendotelceller fra den ventrikelfrie frie væg af rottehjertet

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolering af murine spermatogene celler ved hjælp af en Violet-ophidset celle-permeable DNA bindende dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...