Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Merci au Yale Flow Cytometry Facility, au Flow Cytometry Core Facility de l’Université de Virginie, au Yale Center for Genomic Analysis et au Genome Analysis and Technology Core de l’Université de Virginie pour leurs efforts, leur expertise et leurs conseils dans la contribution aux expériences présentées. Cette étude a été financée par des subventions des NIH à N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) et K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Yale et de l’Université de Virginie ont approuvé toutes les expériences sur les animaux énumérées dans ce protocole.
1. Obtenir des yeux de souris pour l’isolement rétinien
<ol><li>Préparez 1x PBS glacé et ajoutez 500 μL à chaque puits d’une plaque de 48 puits.</li>
	<li>Euthanasier les souris néonatales au sixième jour postnatal (P6) selon les directives approuvées ...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales à partir du tissu rétinien murin postnatal qui a été optimisée pour un nombre élevé de cellules, une pureté et une viabilité. La pureté cellulaire est obtenue par isolement FACS de populations de cellules endothéliales à partir de la suspension unicellulaire digérée par immunomarquage CD31+/CD45-. La qualité de l’isolement est quantifiée dans les essais de viabilité par coloration au bleu de trypan et expression génique par qP...

La capacité à haut débit du séquençage des acides nucléiques via des approches de séquençage de nouvelle génération a grandement fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire. Ces techniques avancées comprennent le séquençage de l’ARN du transcriptome entier, le séquençage de l’ADN des régions ciblées pour identifier les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), le séquençage de l’ADN des facteurs de transcription liés dans le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ou les régions de chromatine ouvertes dans le dosage pour le séquençage de la chromatine accessible par la transposase (ATAC) et le séquençage de l’ARN unicellulaire1 . En biologie vasculaire, ces progrès ont permis aux chercheurs d’élucider des mécanismes complexes de développement et de maladie, ainsi que de distinguer les modèles d’expression génique le long d’un continuum de phénotypesvariés 2,3. Les expériences futures peuvent définir davantage des mécanismes complexes en combinant le séquençage de nouvelle génération avec des modèles évalués de développement vasculaire, mais les méthodes de préparation des échantillons doivent être compatibles avec les techniques de séquençage avancées.
La qualité, la précision et la reproductibilité des approches de séquençage de nouvelle génération dépendent de la méthode de préparation des échantillons. Lors de l’isolement d’un sous-ensemble de cellules ou de la génération de suspensions unicellulaires à partir de tissus, des méthodes optimales de digestion et de purification sont essentielles pour maximiser le nombre de cellules, la viabilité et la pureté de la population cellulaire 4,5. Cela nécessite un équilibre dans la méthode de digestion: une digestion forte est nécessaire pour libérer les cellules du tissu et obtenir suffisamment de cellules pour les approches en aval, mais la viabilité cellulaire sera affectée négativement si la digestion est trop forte 6,7. De plus, la pureté de la population cellulaire est nécessaire pour obtenir des résultats robustes et une analyse précise des données, ce qui peut être accompli via FACS. Cela souligne l’importance d’optimiser les méthodes d’isolement cellulaire pour appliquer le séquençage de nouvelle génération aux modèles établis de développement vasculaire.
Un modèle bien caractérisé pour étudier le développement vasculaire est le modèle de développement vasculaire murin de la rétine. Le système vasculaire murin de la rétine se développe postnatalement dans un plexus superficiel bidimensionnel, avec une germination angiogénique initiale du nerf optique visible au jour postnatal (P)3, un front angiogénique avec des cellules pédoncules et des pointes et une maturation initiale des vaisseaux visibles à P6, et une maturation du plexus vasculaire visible après P9 8,9. Lors du remodelage du plexus vasculaire initial, les cellules endothéliales subissent une spécification vers les phénotypes artériels, capillaires et veineux dans différents vaisseaux pour générer un réseau circulatoire10,11. Par conséquent, cette méthode permet aux chercheurs de visualiser la formation du plexus vasculaire angiogénique et la spécification et la maturation artério-veineuses endothéliales à différents moments du développement9. De plus, ce modèle fournit une méthode pour étudier les effets de la manipulation transgénique sur l’angiogenèse et le développement du plexus vasculaire, qui a été appliquée pour l’étude du développement vasculaire, des malformations artério-veineuses et de la néovascularisation induite par l’oxygène 12,13,14,15,16 . Afin de combiner les approches de séquençage de nouvelle génération avec le modèle de développement vasculaire murin de la rétine, un protocole optimisé pour l’isolement des cellules endothéliales du tissu rétinien est nécessaire.
Ce protocole décrit une méthode optimisée pour digérer le tissu rétinien de souris à P6 afin de maximiser le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Le tissu rétinien est isolé chez des souris P6, digéré pendant 20 minutes, immunocoloré pour CD31 et CD45 et purifié par FACS pour isoler une suspension unicellulaire de cellules endothéliales en environ 2,5 heures (Figure 1A). Ces cellules endothéliales se sont avérées maintenir une viabilité élevée pendant 60 minutes après l’isolement17, ce qui a permis de préparer la bibliothèque pour les méthodes de séquençage de nouvelle génération. De plus, des résultats représentatifs sont fournis pour les résultats de contrôle et de contrôle de la qualité FACS provenant de deux méthodes distinctes de séquençage de nouvelle génération utilisant ce protocole d’isolation : le séquençage de l’ARN du transcriptome entier et le séquençage de l’ARN unicellulaire. Cette méthode permet d’utiliser des approches de séquençage de nouvelle génération en conjonction avec le modèle de vascularisation rétinienne pour élucider de nouveaux mécanismes de développement vasculaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Les améliorations récentes du séquençage de nouvelle génération ont fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire, plusieurs études révélant de nouveaux paradigmes en biologie vasculaire. L’application de ces méthodes à des modèles de développement vasculaire nécessite l’optimisation des techniques d’isolement cellulaire à partir de tissus embryonnaires et postnataux. Le rendement, la viabilité et la pureté des cellules doivent tous être maximaux pour obtenir des résultats précis et reproductibles à partir d’approches de séquençage de nouvelle génération. Le modèle de vascularisation rétinienne de souris néonatale est utilisé par les chercheurs pour étudier les mécanismes du développement vasculaire. Les chercheurs ont utilisé ce modèle pour étudier les mécanismes de l’angiogenèse et la spécification du devenir artériel-veineux pendant la formation et la maturation des vaisseaux sanguins. L’application de techniques de séquençage de nouvelle génération pour étudier le modèle de développement vasculaire rétinien nécessite l’optimisation d’une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes qui maximise le rendement, la viabilité et la pureté cellulaires. Ce protocole décrit une méthode d’isolement, de digestion et de purification des tissus murins de la rétine à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les résultats indiquent que la population de cellules endothéliales CD31+/CD45- purifiées par FACS est fortement enrichie pour l’expression génique des cellules endothéliales et ne présente aucun changement de viabilité pendant 60 minutes après la FACS. Sont inclus les résultats représentatifs des approches de séquençage de nouvelle génération sur les cellules endothéliales isolées à l’aide de cette méthode, y compris le séquençage de l’ARN en vrac et le séquençage de l’ARN unicellulaire, démontrant que cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes est compatible avec les applications de séquençage de la prochaine génération. Cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes permettra des techniques de séquençage avancées pour révéler de nouveaux mécanismes de développement vasculaire.

La digestion du tissu rétinien et l’immunomarquage pour CD31 et CD45 donnent lieu à une population identifiable de cellules endothéliales CD31+/CD45- après vérification des cellules, des cellules individuelles et de la viabilité (figure 2A). L’immunocoloration CD45 est nécessaire pour éliminer les cellules CD31+/CD45+, qui comprennent les plaquettes et certains leucocytes21. Des contrôles doivent être effectués pour chaque expérience afin de montrer la...

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Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.

Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes permettra des techniques de séquençage avancées pour révéler de nouveaux mécanismes de développement vasculaire. Le protocole décrit est optimisé pour des degrés élevés de viabilité et de pureté, qui sont essentiels pour les applications de séquençage de nouvelle génération. Shelby Cain, une étudiante diplômée du laboratoire Hershey, fera la démonstration de la procédure.Commencez à enlever les yeux de la souris néonatale euthanasiée en coupant la peau et la membrane sur l’œil avec une incision perpendiculaire à la paupière à l’aide de ciseaux de dissection. Ensuite, utilisez la pince pour appuyer au-dessus et au-dessous de l’œil afin que l’œil sorte de l’orbite. Pincez soigneusement sous l’œil avec la pince et coupez le nerf optique qui maintient l’œil attaché.Ensuite, placez les deux yeux de la souris dans un puits de la plaque de 48 puits dans le PBS glacé fraîchement préparé jusqu’à la fin de la récolte. Pour isoler le tissu rétinien de la souris, suspendez les yeux dans le tampon de dissection dans une boîte de Petri remplie de 500 microlitres de PBS glacé à l’aide d’un tampon de tuyau de transfert avec une pointe large. En travaillant sous le microscope à dissection, tenez le nerf optique avec une pince fine et utilisez la deuxième pince pour percer le trou à travers la chambre antérieure de l’œil où la cornée et la sclérotique se connectent.Ensuite, déchirez le trou en cercle à environ 75% du chemin autour de la cornée. Tout en tenant le nerf optique avec une pince, utilisez la deuxième pince pour arracher doucement la sclérotique et le corps vitré du tissu rétinien. Pour enlever le cristallin et les vaisseaux du plexus hyaloïde, pénétrez dans la rétine avec une pince ouverte jusqu’à ce qu’elle soit presque touchée, puis fermez la pince pour saisir et tirer le cristallin et les vaisseaux du plexus hyaloïde hors de la rétine.Lorsque tous les vaisseaux sont retirés, placez les rétines dans les tubes microcentrifugeux de deux millilitres remplis de 500 microlitres d’un x PBS glacé. Retirez l’excès de PBS du tube microcentrifuge de deux millilitres avec une pipette en laissant environ 100 microlitres de PBS dans le tube pour couvrir complètement le tissu rétinien. Ajoutez ensuite 500 microlitres de la solution de digestion fraîchement préparée dans le tube.Utilisez une pipette P1000 et un embout de pipette pour pipeter le tissu rétinien dans la solution de digestion cinq fois. Une fois terminé, incuber le mélange de digestion dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 20 minutes en pipetant le mélange de digestion de haut en bas toutes les cinq minutes comme expliqué précédemment. Après l’incubation, le tissu rétinien se dissoudra en une seule suspension cellulaire rendant le mélange de digestion trouble.Ensuite, pelletez les cellules par centrifugation à 375g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après centrifugation, retirer le PBS de la pastille de cellules lavées par pipetage, puis immunocolorer les cellules en remettant la pastille en suspension dans 100 microlitres de solution de coloration d’anticorps par 0,5 fois 10 à la sixième cellule. Incuber la suspension unicellulaire avec la solution de coloration d’anticorps pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité en tapotant le tube toutes les 10 minutes pour mélanger doucement les cellules.Pour le tri cellulaire activé par fluorescence, enduire les cellules par centrifugation à 375 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir retiré le surnageant, laver et granuler les cellules dans 500 microlitres de PBS comme décrit précédemment. Et puis remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de tri cellulaire activé par fluorescence ou tampon FACS en mélangeant doucement avec la pipetta.Ensuite, ajoutez de l’iodure de propidium ou PI comme marqueur de viabilité aux tubes d’échantillon contenant le tampon FACS pour obtenir une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre. Utilisez une pipette pour transférer les suspensions cellulaires à travers un capuchon de crépine contenant un filtre de 35 microns dans un tube à essai de cinq millilitres. Après la filtration, conservez le tube FACS sur de la glace dans l’obscurité, puis transférez le tube dans le trieur de cellules.Allumez l’instrument FACS et l’ordinateur et ouvrez le logiciel FACS pour exécuter et utiliser l’instrument FACS. Effectuer des tests de contrôle de la qualité de routine. Chargez les échantillons de coloration de contrôle dans l’instrument FACS pour ajuster les axes.Commencez avec des cellules d’anticorps IgG uniquement pour générer et ajuster la diffusion vers l’avant et la diffusion latérale. Ensuite, l’anticorps CD31 uniquement pour générer et ajuster CD31. Et puis l’anticorps CD45 uniquement pour générer et ajuster CD45.Enregistrez les données des échantillons de contrôle. Ensuite, chargez les cellules d’échantillon colorées dans l’instrument FACS et exécutez l’échantillon. Démarche des cellules en fonction des paramètres de diffusion vers l’avant ou FSC et de diffusion latérale ou SSC.Cellules de marche par FSCA et FSCH pour identifier les doublets cellulaires et ne collecter que des cellules individuelles. Cellules de marche par IP et SSCA pour identifier les cellules viables. Faire une démarche CD31+CD45 avec des témoins Faire une démarche CD31+CD45 avec des témoins et faire marcher les cellules par CD31 et CD45.Insérez un tube collecteur avec 250 microlitres de tampon FACS dans l’instrument. Ensuite, commencez à trier les cellules CD31+CD45 dans le tube de collecte installé. Gardez les tubes de collecte sur la glace pour une analyse plus approfondie.Les échantillons peuvent être traités pour des applications de séquençage de nouvelle génération. Dans l’étude, la variation du temps de digestion a affecté le rendement cellulaire et le pourcentage de viabilité. Le temps de digestion de 20 minutes a permis d’obtenir un rendement optimal avec un faible pourcentage de cellules endothéliales non viables.Une coloration ultérieure à l’iodure de propidium a démontré que les cellules endothéliales isolées restaient viables pendant 60 minutes après l’isolement. La pureté de la population cellulaire a été évaluée par PCR quantitative ou qPCRR de l’expression des gènes des cellules endothéliales montrant un fort enrichissement pour les gènes des cellules endothéliales dans la population CD31+CD45. Purification de l’ARN des cellules endothéliales isolées Conversion et amplification de l’ADNc par la préparation et le séquençage de la bibliothèque La banque d’ADNc a permis d’identifier plus de 16 000 gènes dans neuf échantillons indépendants.Une baisse des transcrits par million de lectures ou TPM a été observée dans les gènes en dessous de ce seuil. Le séquençage de l’ARN unicellulaire des cellules endothéliales rétiniennes isolées à travers le pipeline 10x Genomics a abouti à une médiane de 1 171 gènes par cellule, 15 247 gènes au total détectés et une médiane de 2 255 identificateurs moléculaires uniques ou numérations UMI par cellule dans 917 cellules. Les étapes critiques de ce protocole sont l’isolement des tissus rétiniens et la digestion des tissus, qui doivent être effectués avec précision comme décrit pour optimiser le rendement cellulaire et la viabilité.Les cellules endothéliales isolées peuvent être utilisées dans des techniques de séquençage avancées telles que le séquençage de l’ARN du transcriptome entier, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine de la chromatine et le dosage du séquençage de la chromatine accessible par la transposase. L’utilisation de cette méthode optimisée en combinaison avec des méthodes de séquençage de nouvelle génération et par des approches informatiques peut élucider davantage les mécanismes des voies de signalisation interconnectées qui régulent les développements vasculaires.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Dérivation efficace des cellules d&#39;épithélium pigmentaire de la rétine à partir de cellules souches

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Recherche

Biologie du développement

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murin fibroblastes dermiques Isolation par FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Analyse du séquençage de l'ARNm à cellule unique multiplexée des cellules embryonnaires de souris

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolement des cellules endocardiques et coronaires endothéliales du mur libre ventriculaire du cœur de rat

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...