Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Vielen Dank an die Yale Flow Cytometry Facility, die University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, das Yale Center for Genomic Analysis und den University of Virginia Genome Analysis and Technology Core für ihre Bemühungen, ihr Fachwissen und ihre Beratung bei der Durchführung der vorgestellten Experimente. Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse an N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) und K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) finanziert.

Die Institutional Animal Care and Use Committees der Yale University und der University of Virginia genehmigten alle in diesem Protokoll aufgeführten Tierversuche.
1. Besorgen Sie sich Mausaugen für die Netzhautisolierung
<ol><li>Bereiten Sie 1x eiskaltes PBS vor und geben Sie 500 μL in jede Vertiefung einer 48-Well-Platte.</li>
	<li>Euthanasieren Sie neugeborene Mäuse am sechsten postnatalen Tag (P6) gemäß genehmigten institutionellen Richtlinien. Für dieses Experime...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus postnatalem murinem Netzhautgewebe, die für eine hohe Zellzahl, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert wurde. Die Zellreinheit wird durch FACS-Isolierung von Endothelzellpopulationen aus der verdauten Einzelzellsuspension durch CD31+/CD45-Immunfärbung erreicht. Die Qualität der Isolierung wird in Assays auf Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung und Genexpression mittels qPCR für CD31, CD45 und VE-Cadherin quantifiziert (obwohl VE-Cad...

Die hohe Durchsatzkapazität der Sequenzierung von Nukleinsäuren über Next-Generation-Sequencing-Ansätze hat das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erheblich erweitert. Diese fortschrittlichen Techniken umfassen die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA, die DNA-Sequenzierung von Zielregionen zur Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die DNA-Sequenzierung gebundener Transkriptionsfaktoren bei der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Sequenzierung oder offene Chromatinregionen in der ATAC-Sequenzierung (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung1 . In der Gefäßbiologie haben diese Fortschritte es den Forschern ermöglicht, komplizierte Mechanismen der Entwicklung und Krankheit aufzuklären und Genexpressionsmuster entlang eines Kontinuums unterschiedlicher Phänotypen zu unterscheiden 2,3. Zukünftige Experimente können komplexe Mechanismen weiter definieren, indem sie die Sequenzierung der nächsten Generation mit evaluierten Modellen der vaskulären Entwicklung kombinieren, aber die Methoden zur Probenvorbereitung müssen mit den fortschrittlichen Sequenzierungstechniken kompatibel sein.
Die Qualität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen hängt von der Methode der Probenvorbereitung ab. Bei der Isolierung einer Untergruppe von Zellen oder der Erzeugung einzelliger Suspensionen aus Geweben sind optimale Verdauungs- und Reinigungsmethoden unerlässlich, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellpopulation zu maximieren 4,5. Dies erfordert ein Gleichgewicht in der Verdauungsmethode: Eine starke Verdauung ist notwendig, um Zellen aus dem Gewebe zu befreien und genügend Zellen für nachgeschaltete Ansätze zu erhalten, aber die Zelllebensfähigkeit wird negativ beeinflusst, wenn die Verdauung zu stark ist 6,7. Darüber hinaus ist die Reinheit der Zellpopulation für robuste Ergebnisse und eine genaue Analyse der Daten erforderlich, die durch FACS erreicht werden kann. Dies unterstreicht die Bedeutung der Optimierung von Zellisolationsmethoden, um die Next-Generation-Sequenzierung auf etablierte Modelle der vaskulären Entwicklung anzuwenden.
Ein gut charakterisiertes Modell zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung ist das murine retinale vaskuläre Entwicklungsmodell. Das murine retinale Gefäßsystem entwickelt sich postnatal in einem zweidimensionalen oberflächlichen Plexus mit anfänglichem angiogenem Sprießen aus dem Sehnerv, sichtbar am postnatalen Tag (P)3, angiogener Front mit Stiel- und Spitzenzellen und anfänglicher Gefäßreifung sichtbar bei P6 und Reifung des vaskulären Plexus sichtbar nach P9 8,9. Während des Umbaus des anfänglichen vaskulären Plexus werden Endothelzellen in verschiedenen Gefäßen in Richtung arterieller, kapillarer und venöser Phänotypen spezifiziert, um ein Kreislaufnetzwerkzu erzeugen 10,11. Daher ermöglicht diese Methode den Forschern, die angiogene Gefäßplexusbildung und die endotheliale arteriell-venöse Spezifikation und Reifung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung sichtbar zu machen9. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen transgener Manipulation auf die Angiogenese und die Entwicklung des vaskulären Plexus, die zur Untersuchung von Gefäßentwicklung, arteriell-venösen Fehlbildungen und sauerstoffinduzierter Neovaskularisation eingesetzt wurde 12,13,14,15,16 . Um Next-Generation-Sequenzierungsansätze mit dem murinen retinalen vaskulären Entwicklungsmodell zu kombinieren, ist ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Endothelzellen aus Netzhautgewebe notwendig.
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Verdauung von Netzhautgewebe von Mäusen bei P6, um die Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit zu maximieren. Netzhautgewebe wird aus P6-Mäusen isoliert, für 20 min verdaut, für CD31 und CD45 immungefärbt und durch FACS gereinigt, um eine Einzelzellsuspension von Endothelzellen in etwa 2,5 h zu isolieren (Abbildung 1A). Es wurde festgestellt, dass diese Endothelzellen 60 Minuten nach der Isolierung eine hohe Lebensfähigkeit aufrechterhalten17, was Bibliothekspräparate für Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation ermöglicht. Darüber hinaus werden repräsentative Ergebnisse für FACS-Gating- und Qualitätskontrollergebnisse aus zwei separaten Next-Generation-Sequenzierungsmethoden unter Verwendung dieses Isolationsprotokolls bereitgestellt: die gesamte Transkriptom-RNA-Sequenzierung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht es, Next-Generation-Sequenzierungsansätze in Verbindung mit dem retinalen Vaskularisationsmodell zu verwenden, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzuklären.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Jüngste Verbesserungen in der Next-Generation-Sequenzierung haben das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erweitert, wobei mehrere Studien neue Paradigmen in der vaskulären Biologie aufdecken. Die Anwendung dieser Methoden auf Modelle der vaskulären Entwicklung erfordert die Optimierung von Zellisolierungstechniken aus embryonalen und postnatalen Geweben. Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit müssen alle maximal sein, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse aus Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation zu erhalten. Das retinale Vaskularisationsmodell der neonatalen Maus wird von Forschern verwendet, um Mechanismen der vaskulären Entwicklung zu untersuchen. Forscher haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der Angiogenese und der arteriell-venösen Schicksalsspezifikation während der Blutgefäßbildung und -reifung zu untersuchen. Die Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungstechniken zur Untersuchung des retinalen vaskulären Entwicklungsmodells erfordert die Optimierung einer Methode zur Isolierung von retinalen Endothelzellen, die die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit maximiert. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Verdauung und Reinigung von retinem retinalem Gewebe unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FACS-gereinigte CD31+/CD45-Endothelzellpopulation für die Genexpression von Endothelzellen stark angereichert ist und keine Veränderung der Lebensfähigkeit für 60 Minuten nach FACS aufweist. Enthalten sind repräsentative Ergebnisse von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen an Endothelzellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, einschließlich Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zeigen, dass diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen kompatibel ist. Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken.

Die Verdauung von Netzhautgewebe und die Immunfärbung für CD31 und CD45 führt zu einer identifizierbaren Population von CD31+/CD45-Endothelzellen nach Gating für Zellen, einzelne Zellen und Lebensfähigkeit (Abbildung 2A). Eine CD45-Immunfärbung ist erforderlich, um CD31+/CD45+-Zellen zu eliminieren, zu denen Blutplättchen und einige Leukozyten gehören21. Für jedes Experiment sollten Kontrollen durchgeführt werden, um die Antikörperspezifität und die Gating...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.

Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken. Das beschriebene Protokoll ist für hohe Lebensfähigkeit und Reinheit optimiert, die für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation unerlässlich sind. Das Verfahren wird von Shelby Cain, einem Doktoranden des Hershey Laboratory, demonstriert.Beginnen Sie, die Augen von der euthanasierten Neugeborenenmaus zu entfernen, indem Sie die Haut und die Membran über dem Auge mit einem senkrechten Schnitt zum Augenlid mit einer Sezierschere abschneiden. Verwenden Sie dann die Pinzette, um über und unter das Auge zu drücken, so dass sich das Auge aus der Augenhöhle bewegt. Kneifen Sie vorsichtig mit der Pinzette unter das Auge und schneiden Sie den Sehnerv, der das Auge befestigt hält.Dann legen Sie beide Augen der Maus bis zur Ernte in eine Vertiefung der 48-Well-Platte im frisch zubereiteten eiskalten PBS. Um das Netzhautgewebe der Maus zu isolieren, hängen Sie die Augen in der Präparierplatte in einer Petrischale auf, die mit 500 Mikrolitern eiskaltem PBS gefüllt ist, indem Sie ein Transferrohrpad mit breiter Spitze verwenden. Arbeiten Sie unter dem Dissektionsmikroskop, halten Sie den Sehnerv mit einer feinen Pinzette und verwenden Sie die zweite Pinzette, um das Loch durch die Vorderkammer des Auges zu stechen, wo sich Hornhaut und Sklera verbinden.Dann reißen Sie das Loch in einem Kreis etwa 75% des Weges um die Hornhaut. Während Sie den Sehnerv mit einer Pinzette halten, verwenden Sie die zweite Pinzette, um die Sklera und den Glaskörper sanft vom Netzhautgewebe abzureißen. Um Linsen- und Hyaloidplexusgefäße zu entfernen, greifen Sie mit einer offenen Pinzette in die Netzhaut, bis Sie sie fast berühren, und schließen Sie dann die Pinzette, um die Linsen- und Hyaloidplexusgefäße aus der Netzhaut zu greifen und herauszuziehen.Wenn alle Gefäße entfernt sind, legen Sie die Netzhaut in die zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die mit 500 Mikrolitern eines x eiskaltem PBS gefüllt sind. Entfernen Sie überschüssiges PBS aus dem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Pipette, wobei etwa 100 Mikroliter PBS in der Röhre verbleiben, um das Netzhautgewebe vollständig zu bedecken. Dann 500 Mikroliter der frisch zubereiteten Aufschlusslösung in das Röhrchen geben.Verwenden Sie eine P1000-Pipette und eine Pipettenspitze, um das Netzhautgewebe in der Verdauungslösung fünfmal auf und ab zu pipettieren. Wenn Sie fertig sind, inkubieren Sie die Verdauungsmischung in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 20 Minuten, wobei die Verdauungsmischung alle fünf Minuten auf und ab pipettiert wird, wie zuvor beschrieben. Nach der Inkubation löst sich das Netzhautgewebe in eine einzellige Suspension auf, wodurch die Verdauungsmischung trüb wird.Als nächstes pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation das PBS aus dem gewaschenen Zellpellet durch Pipettieren entfernen und dann die Zellen immunfärben, indem Sie das Pellet in 100 Mikrolitern Antikörperfärbelösung pro 0,5 mal 10 zu den sechsten Zellen resuspendieren. Inkubieren Sie die einzellige Suspension mit der Antikörperfärbelösung für 30 Minuten auf Eis im Dunkeln, indem Sie alle 10 Minuten auf das Röhrchen klopfen, um die Zellen vorsichtig zu mischen.Für die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 375g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Entfernen des Überstands waschen und pelletieren Sie die Zellen wie zuvor beschrieben in 500 Mikrolitern PBS. Und dann resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikroliter fluoreszenzaktivierter Zellsortierung oder FACS-Puffer durch vorsichtiges Mischen mit der Pipette.Als nächstes fügen Sie Propidiumiodid oder PI als Lebensfähigkeitsmarker zu den Probenröhrchen hinzu, die den FACS-Puffer enthalten, um eine Endkonzentration von 0,5 Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Verwenden Sie eine Pipette, um die Zellsuspensionen durch eine Schnappkappe des Zellsiebs, die einen 35-Mikron-Filter enthält, in ein Fünf-Milliliter-Reagenzglas zu überführen. Nach der Filtration halten Sie das FACS-Rohr im Dunkeln auf Eis und übergeben Sie das Röhrchen dann in den Zellsortierer.Schalten Sie das FACS-Instrument und den Computer ein und öffnen Sie die FACS-Software, um das FACS-Instrument auszuführen und zu bedienen. Führen Sie routinemäßige Qualitätskontrolltests durch. Legen Sie die Kontrollfleckenproben in das FACS-Instrument, um die Achsen anzupassen.Beginnen Sie mit reinen IgG-Antikörperzellen, um Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung zu erzeugen und anzupassen. Dann CD31-Antikörper nur, um CD31 zu erzeugen und anzupassen. Und dann CD45-Antikörper nur, um CD45 zu erzeugen und anzupassen.Notieren Sie die Daten aus den Kontrollproben. Als nächstes laden Sie die gefärbten Probenzellen in das FACS-Instrument und führen die Probe aus. Gang der Zellen basierend auf Vorwärtsstreuung oder FSC und Seitenstreuung oder SSC-Parametern.Gangzellen von FSCA und FSCH zur Identifizierung von Zelldubletten und zur Entnahme von nur Einzelzellen. Gangzellen durch PI und SSCA zur Identifizierung lebensfähiger Zellen. Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen Machen Sie einen CD31+CD45-Gang mit Bedienelementen und gehen Sie die Zellen mit CD31 und CD45.Führen Sie ein Sammelröhrchen mit 250 Mikrolitern FACS-Puffer in das Gerät ein. Als nächstes beginnen Sie mit der Sortierung von Zellen CD31+CD45 in das installierte Sammelrohr. Bewahren Sie die Sammelröhrchen zur weiteren Analyse auf Eis auf.Die Proben können für Sequenzierungsanwendungen der nächsten Generation aufbereitet werden. In der Studie beeinflusste die Variation der Verdauungszeit den Zellertrag und den Prozentsatz der Lebensfähigkeit. Die Verdauungszeit von 20 Minuten führte zu einer optimalen Ausbeute mit einem geringen Anteil an nicht lebensfähigen Endothelzellen.Die anschließende Propidiumiodid-Färbung zeigte, dass die isolierten Endothelzellen nach der Isolierung 60 Minuten lang lebensfähig blieben. Die Reinheit der Zellpopulation wurde durch quantitative PCR- oder qPCRR-Analyse der Expression von Endothelzellgenen bewertet, die eine starke Anreicherung für Endothelzellgene in der CD31+CD45-Population zeigten. Reinigung von RNA aus den isolierten Endothelzellen, die cDNA durch Bibliothekspräparation und Sequenzierung umwandeln und amplifizieren Die cDNA-Bibliothek führte zu mehr als 16.000 Genen, die in neun unabhängigen Proben identifiziert wurden.Ein Abfall der Transkripte pro Million Lesevorgänge oder TPM wurde in Genen unterhalb dieser Schwelle beobachtet. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung der isolierten retinalen Endothelzellen durch die 10x Genomics-Pipeline führte zu einem Median von 1.171 Genen pro Zelle, 15.247 nachgewiesenen Genen und einem Median von 2.255 eindeutigen molekularen Identifikatoren oder UMI-Zählungen pro Zelle in 917 Zellen. Die kritischen Schritte in diesem Protokoll sind die Netzhautgewebeisolierung und die Gewebeverdauung, die genau wie beschrieben durchgeführt werden sollten, um den Zellertrag und die Lebensfähigkeit zu optimieren.Die isolierten Endothelzellen können in fortgeschrittenen Sequenzierungstechniken wie der Ganztranskriptom-RNA-Sequenzierung, Einzelzell-RNA-Sequenzierung, Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierung und Assay für Transposase-zugängliche Chromatinsequenzierung verwendet werden. Der Einsatz dieser optimierten Methode in Kombination mit Next-Generation-Sequenzierungsmethoden und durch computergestützte Ansätze kann die Mechanismen miteinander verbundener Signalwege, die vaskuläre Entwicklungen regulieren, weiter aufklären.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolierung der endothelialen Vorläuferzellen aus menschlichen Nabelschnurblut

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolierung von Endokardialen und koronaren Endothelzellen aus der ventrikulären freien Wand des Rattenherzes

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolierung von murinen Spermatogenic Cells mit einem violett-erregten Zellpermeable DNA Binding Dye

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...