Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Yale Flow Cytometry施設、バージニア大学フローサイトメトリーコア施設、Yale Center for Genomic Analysis、およびUniversity of Virginia Genome Analysis and Technology Coreの方々に、提示された実験に貢献するための努力、専門知識、アドバイスをいただき、ありがとうございます。この研究は、N.W.C.(T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650), およびK.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765)へのNIH助成金によって資金提供された。

イェール大学とバージニア大学の施設動物管理および使用委員会は、このプロトコルに記載されているすべての動物実験を承認しました。
1.網膜分離のためのマウスの目を取得します
<ol><li>氷冷PBSを1回調製し、48ウェルプレートの各ウェルに500 μLを加えます。</li>
	<li>承認された施設のガイドラインに従って、生後6日目(P6)に新生児マウスを安楽死させます...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

このプロトコルは、高い細胞数、純度、および生存率のために最適化された、出生後のマウス網膜組織から内皮細胞を単離する方法を説明しています。細胞純度は、CD31+/CD45-免疫染色による消化された単一細胞懸濁液からの内皮細胞集団のFACS単離によって得られます。単離の質は、トリパンブルー染色による生存率およびCD31、CD45、およびVE-カドヘリンのqPCRによる遺伝子発現のアッセイで定?...

次世代シーケンシングアプローチによる核酸シーケンシングのハイスループット能力は、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識を大幅に進歩させました。これらの高度な技術には、全トランスクリプトームRNAシーケンシング、一塩基多型(SNP)を特定するための標的領域のDNAシーケンシング、クロマチン免疫沈降(ChIP)シーケンシングにおける結合転写因子のDNAシーケンシング、またはトランスポザーゼアクセスクロマチンシーケンシング(ATAC)シーケンシングのアッセイにおけるオープンクロマチン領域、およびシングルセルRNAシーケンシングが含まれます1.血管生物学では、これらの進歩により、研究者は発生と疾患の複雑なメカニズムを解明し、さまざまな表現型の連続体に沿って遺伝子発現パターンを区別することができました2,3。将来の実験では、次世代シーケンシングと血管発生の評価モデルを組み合わせることで複雑なメカニズムをさらに定義できますが、サンプル調製の方法は高度なシーケンシング技術と互換性がある必要があります。
次世代シーケンシングアプローチの品質、精度、再現性は、サンプル調製の方法によって異なります。細胞のサブセットを単離したり、組織から単一細胞懸濁液を生成したりする場合、細胞集団の細胞数、生存率、および純度を最大化するには、最適な消化および精製方法が不可欠です4,5。これには消化方法のバランスが必要です:組織から細胞を放出し、下流のアプローチに十分な細胞を得るためには強力な消化が必要ですが、消化が強すぎると細胞の生存率に悪影響を及ぼします6,7。さらに、細胞集団の純度は、堅牢な結果とデータの正確な分析に必要であり、FACSを通じて達成できます。これは、血管発生の確立されたモデルに次世代シーケンシングを適用するために、細胞分離方法を最適化することの重要性を浮き彫りにしています。
血管の発達を調べるための十分に特徴付けられたモデルは、マウス網膜血管発達モデルです。マウス網膜血管系は出生後に2次元の表在神経叢で発達し、出生後(P)3に視神経からの最初の血管新生が見られ、P6に茎細胞と先端細胞を伴う血管新生前部と初期血管成熟が見られ、P9後に血管叢の成熟が見られます8,9。初期血管神経叢のリモデリングの間、内皮細胞は、循環ネットワークを生成するために、異なる血管における動脈、毛細血管、および静脈表現型に向かって仕様化を受ける10、11。したがって、この方法は、研究者が血管新生血管叢形成および内皮動脈静脈の仕様および成熟を、発生中の様々な時点で視覚化することを可能にする9。さらに、このモデルは、血管新生および血管神経叢の発達に対するトランスジェニック操作の影響を調べるための方法を提供し、血管の発達、動脈静脈奇形、および酸素誘発性血管新生の研究に適用されています12,13,14,15,16。.次世代シーケンシングアプローチとマウス網膜血管発生モデルを組み合わせるには、網膜組織から内皮細胞を単離するための最適化されたプロトコルが必要です。
このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率を最大化するために、P6でマウスの網膜組織を消化するための最適化された方法を説明しています。網膜組織をP6マウスから単離し、20分間消化し、CD31およびCD45について免疫染色し、FACSを通して精製して、約2.5時間で内皮細胞の単一細胞懸濁液を単離した(図1A)。これらの内皮細胞は、単離後60分間高い生存率を維持することが判明し17、次世代シーケンシング法のためのライブラリ調製を可能にしました。さらに、この分離プロトコルを使用した2つの別々の次世代シーケンシングメソッド(全トランスクリプトームRNAシーケンシングとシングルセルRNAシーケンシング)からのFACSゲーティングおよび品質管理結果に関する代表的な結果が得られます。この方法により、次世代シーケンシングアプローチを網膜血管新生モデルと組み合わせて使用することで、血管発生の新しいメカニズムを解明することができます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

次世代シーケンシングの最近の改善により、分子生物学および細胞生物学に関する研究者の知識が進歩し、いくつかの研究により血管生物学の新しいパラダイムが明らかになりました。これらの方法を血管発生のモデルに適用するには、胚および出生後の組織からの細胞分離技術の最適化が必要です。細胞収量、生存率、純度はすべて、次世代シーケンシングアプローチから正確で再現性のある結果を得るために最大である必要があります。新生児マウス網膜血管新生モデルは、血管発生のメカニズムを研究するために研究者によって使用されます。研究者は、このモデルを使用して、血管形成および成熟中の血管新生および動脈静脈運命の仕様のメカニズムを調査しました。次世代シーケンシング技術を適用して網膜血管発生モデルを研究するには、細胞収量、生存率、および純度を最大化する網膜内皮細胞の単離方法の最適化が必要です。このプロトコルは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用したマウス網膜組織の単離、消化、および精製の方法について説明しています。結果は、FACS精製CD31+/CD45-内皮細胞集団が内皮細胞の遺伝子発現に対して高度に濃縮されており、FACS後60分間生存率に変化を示さないことを示しています。バルクRNAシーケンシングやシングルセルRNAシーケンシングなど、この方法を使用して単離された内皮細胞に対する次世代シーケンシングアプローチの代表的な結果が含まれており、網膜内皮細胞単離のためのこの方法が次世代シーケンシングアプリケーションと互換性があることを示しています。網膜内皮細胞単離のこの方法は、血管発生の新しいメカニズムを明らかにするための高度なシーケンシング技術を可能にします。

網膜組織の消化とCD31およびCD45の免疫染色により、細胞、単一細胞、および生存率をゲーティングした後、CD31+/CD45-内皮細胞の識別可能な集団が得られます(図2A)。CD45免疫染色は、血小板および一部の白血球を含むCD31+/CD45+細胞を除去するために必要です21。抗体特異性を示し、ゲーティング戦略を導くために、実験ごとにコントロールを実行する必要が...

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Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

このプロトコルは、細胞収量、純度、および生存率に最適化されたマウス生後網膜内皮細胞の単離方法について説明しています。これらの細胞は、次世代シーケンシングアプローチに適しています。

次世代シーケンシングのためのマウス網膜内皮細胞の単離

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

網膜内皮細胞単離のこの方法は、血管発生の新しいメカニズムを明らかにするための高度なシーケンシング技術を可能にします。記載されているプロトコルは、次世代シーケンシングアプリケーションに不可欠な高レベルの実行可能性と純度に最適化されています。手順を実演するのは、ハーシー研究所の大学院生であるシェルビー・ケインです。解剖ハサミを使用してまぶたを垂直に切開して目の上の皮膚と膜を切り取ることにより、安楽死させた新生児マウスから目の除去を開始します。次に、鉗子を使用して目の上下を押し下げ、目がソケットから出るようにします。鉗子で目の下を慎重につまみ、目をくっつけたままの視神経を切断します。次に、マウスからの両眼を、収穫が終了するまで、新たに調製した氷冷PBSの48ウェルプレートのウェルに入れます。マウス網膜組織を単離するには、先端の広いトランスファーパイプパッドを使用して、500マイクロリットルの氷冷PBSで満たされたペトリ皿の解剖パッドに目を吊り下げます。解剖顕微鏡下で作業し、1つの細かい鉗子で視神経を保持し、2番目の鉗子を使用して、角膜と強膜が接続する目の前房に穴を開けます。次に、角膜の周りの約75%の円で穴を引き裂きます。1つの鉗子で視神経を保持しながら、2番目の鉗子を使用して、強膜と硝子体を網膜組織からそっと引き裂きます。水晶体と腌骨神経叢の血管を取り除くには、開いた鉗子で網膜に手を伸ばし、ほとんど触れるまで網膜に手を伸ばし、次に鉗子を閉じて水晶体と顎骨神経叢の血管をつかんで網膜から引き出します。すべての血管を取り外したら、500マイクロリットルの氷冷PBS1本で満たされた2ミリリットルのマイクロ遠心チューブに網膜を入れます。2ミリリットルの微量遠心チューブから余分なPBSをピペットで取り除き、チューブ内に約100マイクロリットルのPBSを残して網膜組織を完全に覆います。次に、500マイクロリットルの新たに調製した消化溶液をチューブに加えます。P1000ピペッタとピペットチップを使用して、消化液中の網膜組織を5回ピペットで上下させます。完了したら、前に説明したように、消化混合物を摂氏37度の水浴で20分間インキュベートし、消化混合物を5分ごとに上下にピペッティングします。インキュベーション後、網膜組織は単一の細胞懸濁液に溶解し、消化混合物を濁らせます。次に、摂氏4度で5分間375gで遠心分離することにより細胞をペレット化した。遠心分離後、ピペッティングにより洗浄した細胞ペレットからPBSを取り出し、次いで該ペレットを100マイクロリットルの抗体染色液あたり10〜6番目の細胞に0.5倍再懸濁して細胞を免疫染色する。単一細胞懸濁液を抗体染色溶液とともに氷上で30分間インキュベートし、10分ごとにチューブを軽くたたいて細胞を穏やかに混合します。蛍光活性化細胞選別では、375gで4°Cで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。上清を除去した後、細胞を洗浄し、前述のように500マイクロリットルのPBSでペレット化する。次いで、ピペッタと穏やかに混合することにより300マイクロリットルの蛍光活性化細胞選別またはFACS緩衝液に細胞を再懸濁する。次に、FACSバッファーを含むサンプルチューブに生存マーカーとしてヨウ化プロピジウムまたはPIを添加し、ミリリットルあたり0.5マイクログラムの最終濃度を取得します。ピペットを使用して、35ミクロンのフィルターが入ったセルストレーナースナップキャップを通して細胞懸濁液を5ミリリットルの試験管に移します。ろ過後、FACSチューブを暗所で氷上に保ち、チューブをセルソーターに移します。FACS機器とコンピュータの電源を入れ、FACSソフトウェアを開いてFACS機器を実行および操作します。定期的な品質管理テストを実行します。コントロール染色サンプルをFACS装置にロードして、軸を調整します。IgG抗体のみの細胞から始めて、前方散乱と側方散乱を生成および調整します。次にCD31抗体のみをCD31を生成・調整する。そしてCD45抗体のみを生成・調整する。対照サンプルからのデータを記録します。次に、染色したサンプル細胞をFACS装置にロードし、サンプルを実行します。前方散乱またはFSCおよび側方散乱またはSSCパラメータに基づいて細胞を歩行します。FSCAとFSCHによって細胞を歩き、細胞ダブレットを識別し、単一細胞のみを収集します。PIおよびSSCAにより細胞を歩行し、生細胞を同定する。コントロールでCD31 + CD45歩行を行うコントロールでCD31 + CD45歩行を行い、CD31とCD45で細胞を歩行します。250マイクロリットルのFACSバッファーが入った収集チューブを機器に挿入します。次に、CD31 + CD45である細胞を、取り付けられた収集チューブに分類し始めます。さらなる分析のために、収集チューブを氷の上に置いてください。サンプルは、次世代シーケンシングアプリケーション用に処理できます。この研究では、消化時間を変えると、細胞収量と生存率に影響しました。20分の消化時間は、生存不能な内皮細胞の割合が低い状態で最適な収量をもたらしました。その後のヨウ化プロピジウム染色は、単離された内皮細胞が単離後60分間生存し続けることを実証した。細胞集団の純度は、CD31+CD45集団における内皮細胞遺伝子の強い濃縮を示す内皮細胞遺伝子の発現の定量的PCRまたはqPCR分析によって評価した。単離された内皮細胞からのRNAの精製 ライブラリ調製およびシーケンシングによるcDNAの変換および増幅 cDNAライブラリは、9つの独立したサンプルで同定された16, 000を超える遺伝子をもたらしました。100万リードあたりの転写物の低下またはTPMは、この閾値を下回る遺伝子で観察されました。10x Genomicsパイプラインを介した単離された網膜内皮細胞のシングルセルRNAシーケンシングは、917細胞において細胞当たり1, 171遺伝子の中央値、15, 247個の全遺伝子が検出され、および中央値2, 255個の細胞当たりの一意の分子識別子またはUMIカウントをもたらした。このプロトコルの重要なステップは、網膜組織の分離と組織消化であり、細胞収量と生存率を最適化するために、説明されているように正確に実行する必要があります。単離された内皮細胞は、全トランスクリプトームRNAシーケンシング、シングルセルRNAシーケンシング、クロマチン免疫沈降シーケンシング、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチンシーケンシングのアッセイなどの高度なシーケンシング技術に使用できます。この最適化された手法を次世代シーケンシング法と組み合わせ、計算論的アプローチと組み合わせることで、血管の発達を制御する相互接続されたシグナル伝達経路のメカニズムをさらに解明することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

幹細胞から網膜色素上皮細胞の効率的な導出

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

ひと臍帯血由来の血管内皮前駆細胞の分離

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

ラット心臓の心室自由壁からの心内膜細胞と冠状動脈内皮細胞の分離

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...