Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Takk til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres innsats, kompetanse og råd for å bidra til de presenterte eksperimentene. Denne studien ble finansiert av NIH-tilskudd til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

De institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteene ved Yale University og University of Virginia godkjente alle dyreforsøk som er oppført i denne protokollen.
1. Få museøyne for retinal isolasjon
<ol><li>Forbered 1x iskald PBS og tilsett 500 μL til hver brønn på en 48-brønns plate.</li>
	<li>Avlive nyfødte mus på barseldag seks (P6) i henhold til godkjente institusjonelle retningslinjer. I dette forsøket avlives kull på ca. 4-8 nyfødte mus ved P6 via isofl...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Denne protokollen beskriver en metode for isolering av endotelceller fra postnatal murine retinalt vev som er optimalisert for høyt celletall, renhet og levedyktighet. Cellerenhet oppnås ved FACS-isolering av endotelcellepopulasjoner fra fordøyd enkeltcellesuspensjon ved CD31 + / CD45- immunostaining. Kvaliteten på isolasjon kvantifiseres i analyser for levedyktighet ved Trypan blå farging og genuttrykk av qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selv om VE-Cadherin ikke ble brukt til immunostaining). De kritiske trinnen...

Den høye gjennomstrømningskapasiteten til sekvensering av nukleinsyrer via neste generasjons sekvenseringsmetoder har i stor grad avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi. Disse avanserte teknikkene inkluderer hele transkriptom-RNA-sekvensering, DNA-sekvensering av målrettede regioner for å identifisere Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), DNA-sekvensering av bundne transkripsjonsfaktorer i Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) sekvensering, eller åpne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekvensering og enkeltcellet RNA-sekvensering1 . I vaskulær biologi har disse fremskrittene gjort det mulig for forskere å belyse kompliserte mekanismer for utvikling og sykdom, sammen med å skille genuttrykksmønstre langs et kontinuum av varierende fenotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan videre definere komplekse mekanismer ved å kombinere neste generasjons sekvensering med evaluerte modeller for vaskulær utvikling, men metodene for prøvepreparering må være kompatible med de avanserte sekvenseringsteknikkene.
Kvaliteten, nøyaktigheten og reproduserbarheten av neste generasjons sekvenseringsmetoder avhenger av metoden for prøvepreparering. Når du isolerer en delmengde av celler eller genererer enkeltcellesuspensjoner fra vev, er optimale fordøyelses- og rensemetoder avgjørende for å maksimere cellenummer, levedyktighet og renhet av cellepopulasjonen 4,5. Dette krever en balanse i fordøyelsesmetoden: sterk fordøyelse er nødvendig for å frigjøre celler fra vevet og få nok celler til nedstrøms tilnærminger, men cellens levedyktighet vil bli negativt påvirket hvis fordøyelsen er for sterk 6,7. I tillegg er renhet av cellepopulasjonen nødvendig for robuste resultater og nøyaktig analyse av data, som kan oppnås gjennom FACS. Dette fremhever viktigheten av å optimalisere celleisolasjonsmetoder for å anvende neste generasjons sekvensering på etablerte modeller for vaskulær utvikling.
En godt karakterisert modell for å undersøke vaskulær utvikling er murine retinal vaskulær utviklingsmodell. Murine retinal vaskulatur utvikler seg postnatalt i en todimensjonal overfladisk plexus, med initial angiogen spiring fra synsnerven synlig på barseldag (P)3, angiogen front med stilk- og spissceller og initial karmodning synlig ved P6, og modning av vaskulær plexus synlig etter P9 8,9. Under ombyggingen av den første vaskulære plexus gjennomgår endotelceller spesifikasjon mot arterielle, kapillære og venøse fenotyper i forskjellige kar for å generere et sirkulasjonsnettverk10,11. Derfor tillater denne metoden forskere å visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelial arteriell venøs spesifikasjon og modning på ulike tidspunkter under utvikling9. I tillegg gir denne modellen en metode for å undersøke effekten av transgen manipulasjon på angiogenese og vaskulær plexusutvikling, som har blitt brukt til undersøkelse av vaskulær utvikling, arterielle venøse misdannelser og oksygenindusert neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For å kombinere neste generasjons sekvenseringsmetoder med murine retinal vaskulær utviklingsmodell, er det nødvendig med en optimalisert protokoll for isolering av endotelceller fra retinalt vev.
Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å fordøye retinalvev fra mus ved P6 for å maksimere celleutbytte, renhet og levedyktighet. Retinalt vev isoleres fra P6-mus, fordøyes i 20 minutter, immunostaineres for CD31 og CD45, og renses gjennom FACS for å isolere en enkeltcellesuspensjon av endotelceller i ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelcellene ble funnet å opprettholde høy levedyktighet i 60 minutter etter isolasjon17, noe som gjorde det mulig å forberede bibliotekforberedelser for neste generasjons sekvenseringsmetoder. I tillegg er det gitt representative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrollresultater fra to separate neste generasjons sekvenseringsmetoder ved bruk av denne isolasjonsprotokollen: hel transkriptom RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering. Denne metoden gjør det mulig å bruke neste generasjons sekvenseringsmetoder i forbindelse med retinal vaskulariseringsmodellen for å belyse nye mekanismer for vaskulær utvikling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering har avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi, med flere studier som avslører nye paradigmer i vaskulær biologi. Bruk av disse metodene til modeller for vaskulær utvikling krever optimalisering av celleisolasjonsteknikker fra embryonale og postnatale vev. Celleutbytte, levedyktighet og renhet må alle være maksimale for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater fra neste generasjons sekvenseringsmetoder. Neonatal mus retinal vaskulariseringsmodell brukes av forskere til å studere mekanismer for vaskulær utvikling. Forskere har brukt denne modellen til å undersøke mekanismer for angiogenese og arteriell venøs skjebnespesifikasjon under blodkardannelse og modning. Bruk av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å studere retinal vaskulær utviklingsmodell krever optimalisering av en metode for isolering av retinale endotelceller som maksimerer celleutbyttet, levedyktighet og renhet. Denne protokollen beskriver en metode for murine retinal vevsisolering, fordøyelse og rensing ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Resultatene indikerer at den FACS-rensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulasjonen er svært beriket for endotelcellegenuttrykk og viser ingen endring i levedyktighet i 60 minutter etter FACS. Inkludert er representative resultater av neste generasjons sekvenseringsmetoder på endotelceller isolert ved hjelp av denne metoden, inkludert bulk RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering, noe som viser at denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon er kompatibel med neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. Denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon vil tillate avanserte sekvenseringsteknikker for å avsløre nye mekanismer for vaskulær utvikling.

Fordøyelse av retinalt vev og immunfarging for CD31 og CD45 resulterer i en identifiserbar populasjon av CD31+/CD45-endotelceller etter gating for celler, enkeltceller og levedyktighet (figur 2A). CD45-immunostaining er nødvendig for å eliminere CD31+/CD45+-celler, som inkluderer blodplater og noen leukocytter21. Kontroller bør utføres for hvert forsøk for å vise antistoffspesifisitet og veiledningsstrategi (figur 2B). Denne prosen...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Denne protokollen beskriver en metode for isolering av murine postnatale retinale endotelceller optimalisert for celleutbytte, renhet og levedyktighet. Disse cellene er egnet for neste generasjons sekvenseringsmetoder.

Isolering av murine retinale endotelceller for neste generasjons sekvensering

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon vil tillate avanserte sekvenseringsteknikker for å avsløre nye mekanismer for vaskulær utvikling. Den beskrevne protokollen er optimalisert for høye grader av levedyktighet og renhet, noe som er avgjørende for neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. Demonstrere prosedyren vil være Shelby Cain, en kandidatstudent fra Hershey Laboratory.Begynn å fjerne øynene fra den avlivede nyfødte musen ved å kutte bort huden og membranen over øyet med et vinkelrett snitt på øyelokket ved hjelp av disseksjonssaks. Bruk deretter tangen til å trykke ned over og under øyet slik at øyet beveger seg ut av kontakten. Klyp forsiktig under øyet med tangen og kutt optisk nerve som holder øyet festet.Legg deretter begge øynene fra musen i en brønn på 48-brønnsplaten i den nylagde iskalde PBS til ferdig høsting. For å isolere musens retinale vev, suspendere øynene i disseksjonsputen i en petriskål fylt med 500 mikroliter iskald PBS ved hjelp av en overføringsrørpute med en bred spiss. Arbeid under disseksjonsmikroskopet, hold optisk nerve med en fin tang og bruk den andre tangen til å pierce hullet gjennom øyets fremre kammer der hornhinnen og sclera forbinder.Riv deretter hullet i en sirkel omtrent 75% av veien rundt hornhinnen. Mens du holder optisk nerve med en tang, bruk den andre tangen til å forsiktig rive sclera og glasslegemet av retinalvevet. For å fjerne linse- og hyaloid plexuskar, nå inn i netthinnen med åpne tang til du nesten berører den, og lukk deretter tangene for å gripe og trekke linsen og hyaloid plexuskarene ut fra netthinnen.Når alle fartøyene er fjernet, plasser netthinnen i de to milliliter mikro-sentrifugerørene fylt med 500 mikroliter av en x iskald PBS. Fjern overflødig PBS fra to milliliter mikro-sentrifugerrør med en pipette som etterlater ca. 100 mikroliter PBS i røret for å dekke retinalvevet helt. Tilsett deretter 500 mikroliter av den tilberedte fordøyelsesløsningen til røret.Bruk en P1000 pipetta og pipettespiss til pipetten opp og ned i netthinnevevet i fordøyelsesløsningen fem ganger. Når du er ferdig, inkuberer fordøyelsesblandingen i et 37 grader Celsius vannbad i 20 minutter med pipettering av fordøyelsesblandingen opp og ned hvert femte minutt som forklart før. Etter inkubering vil retinalvevet oppløses i en enkeltcellesuspensjon som gjør fordøyelsesblandingen overskyet.Deretter pelleterer cellene ved sentrifugering ved 375g i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter sentrifugering, fjern PBS fra den vaskede cellepelleten ved pipettering og immunstain deretter cellene ved å resuspendere pelleten i 100 mikroliter antistofffargingsløsning per 0,5 ganger 10 til de sjette cellene. Inkuber enkeltcellesuspensjonen med antistofffargingsløsningen i 30 minutter på is i mørket ved å banke på røret hvert 10. minutt for å blande cellene forsiktig.For fluorescensaktivert cellesortering, pellet cellene ved sentrifugering ved 375g i fem minutter ved fire grader Celsius. Etter å ha fjernet supernatanten, vask og pellet cellene i 500 mikroliter PBS som beskrevet før. Og deretter resuspendere cellene i 300 mikroliter fluorescensaktivert cellesortering eller FACS-buffer ved forsiktig blanding med pipetta.Deretter legger du til propidiumjodid eller PI som en levedyktighetsmarkør til prøverørene som inneholder FACS-bufferen for å få en endelig konsentrasjon på 0,5 mikrogram per milliliter. Bruk en pipette til å overføre cellesuspensjonene gjennom en cellesilhette som inneholder et 35 mikron filter til et fem milliliter reagensrør. Etter filtrering, hold FACS-røret på is i mørket og overfør deretter røret til cellesortereren.Slå på FACS-instrumentet og datamaskinen, og åpne FACS-programvaren for å kjøre og betjene FACS-instrumentet. Utfør rutinemessige kvalitetskontrolltester. Legg kontrollflekkprøvene i FACS-instrumentet for å justere aksene.Start med IgG antistoff bare celler for å generere og justere fremover spredning og side scatter. Deretter CD31 antistoff bare for å generere og justere CD31. Og så CD45 antistoff bare for å generere og justere CD45.Registrer dataene fra kontrolleksemplene. Deretter laster du de fargede prøvecellene inn i FACS-instrumentet og kjører prøven. Gang cellene basert på fremover scatter eller FSC og side scatter eller SSC parametere.Gangceller av FSCA og FSCH for å identifisere celledobler og bare samle enkeltceller. Gangceller av PI og SSCA for å identifisere levedyktige celler. Lag en CD31+CD45-gange med kontroller Lag en CD31+CD45-gang med kontroller og gang cellene etter CD31 og CD45.Sett inn et oppsamlingsrør med 250 mikroliter FACS-buffer i instrumentet. Deretter begynner du å sortere celler som er CD31 + CD45 - inn i det installerte oppsamlingsrøret. Hold oppsamlingsrørene på is for videre analyse.Prøvene kan behandles for neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. I studien påvirket varierende fordøyelsestid celleutbyttet og levedyktighetsprosenten. Fordøyelsestiden på 20 minutter resulterte i et optimalt utbytte med en lav prosentandel av ikke-levedyktige endotelceller.Påfølgende propidiumjodidfarging viste at de isolerte endotelcellene holdt seg levedyktige i 60 minutter etter isolering. Cellepopulasjonens renhet ble vurdert ved kvantitativ PCR- eller qPCRR-analyse av ekspresjonen av endotelcellegener som viste sterk anrikning for endotelcellegener i CD31 + CD45-populasjonen. Rensing av RNA fra de isolerte endotelcellene som konverterer og forsterker cDNA gjennom bibliotekforberedelse og sekvensering cDNA-biblioteket resulterte i mer enn 16.000 gener identifisert i ni uavhengige prøver.Et frafall i transkripsjoner per million avlesninger eller TPM ble observert i gener under denne terskelen. Enkeltcellet RNA-sekvensering av de isolerte retinale endotelcellene gjennom 10x Genomics-rørledningen resulterte i en median på 1.171 gener per celle, 15.247 totale gener oppdaget, og en median på 2.255 unike molekylære identifikatorer eller UMI-tellinger per celle i 917 celler. De kritiske trinnene i denne protokollen er retinal vevsisolering og vevsfordøyelse, som bør utføres nøyaktig som beskrevet for å optimalisere celleutbyttet og levedyktigheten.De isolerte endotelcellene kan brukes i avanserte sekvenseringsteknikker som heltransskriptom RNA-sekvensering, enkeltcellet RNA-sekvensering, kromatinimmunoprecipitasjonssekvensering og analyse for transposase-tilgjengelig kromatinsekvensering. Bruken av denne optimaliserte metoden i kombinasjon med neste generasjons sekvenseringsmetoder og ved beregningsmetoder kan ytterligere belyse mekanismene for sammenkoblede signalveier som regulerer vaskulær utvikling.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Effektiv Utledning av retinal pigment epitelet Celler fra stamceller

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Muse Dermal Fibroblast Isolering av FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering av Murine Embryonic Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Isolering av endoteliale Progenitor celler fra menneskelige navlestrengsblod

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rask, rettet differensiering av netthinnens Pigment epitelceller fra menneskelige embryonale eller indusert Pluripotent stamceller

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Multiplekset enkelt celle mRNA sekvensering analyse av Mouse embryonale celler

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Utarbeidelse av små RNA biblioteker for sekvensering fra tidlig mus embryoer

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Isolering av endokardiale og koronar endotelceller fra Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Isolering av murine spermatogene celler ved hjelp av en violet-spent celle-gjennomtrengelig DNA bindende fargestoff

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...