Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Спасибо Йельскому центру проточной цитометрии, Центру проточной цитометрии Университета Вирджинии, Йельскому центру геномного анализа и Технологическому ядру Университета Вирджинии за их усилия, опыт и советы по участию в представленных экспериментах. Это исследование финансировалось грантами NIH N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) и K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Институциональные комитеты по уходу за животными и их использованию Йельского университета и Университета Вирджинии одобрили все эксперименты на животных, перечисленные в этом протоколе.
1. Получите мышиные глаза для изоляции сетчатки
<ol><li>Приготовьте 1x ледя?...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Этот протокол описывает метод выделения эндотелиальных клеток из постнатальной мышиной ткани сетчатки, который был оптимизирован для высокого количества клеток, чистоты и жизнеспособности. Чистота клеток достигается путем выделения FACS популяций эндотелиальных клеток из переваренн?...

Высокая пропускная способность секвенирования нуклеиновых кислот с помощью подходов к секвенированию следующего поколения значительно расширила знания исследователей в области молекулярной и клеточной биологии. Эти передовые методы включают секвенирование РНК всего транскриптома, секвенирование ДНК целевых областей для идентификации однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), секвенирование ДНК связанных факторов транскрипции в секвенировании иммунопреципитации хроматина (ChIP) или открытые области хроматина в анализе для секвенирования транспозазно-доступного хроматина (ATAC) и секвенирование одноклеточной РНК1 . В сосудистой биологии эти достижения позволили исследователям прояснить сложные механизмы развития и заболевания, а также различать паттерны экспрессии генов в континууме различных фенотипов 2,3. Будущие эксперименты могут дополнительно определить сложные механизмы, объединив секвенирование следующего поколения с оцененными моделями развития сосудов, но методы подготовки образцов должны быть совместимы с передовыми методами секвенирования.
Качество, точность и воспроизводимость подходов к секвенированию следующего поколения зависят от метода подготовки образцов. При выделении подмножества клеток или генерации одноклеточных суспензий из тканей оптимальные методы пищеварения и очистки необходимы для максимизации количества клеток, жизнеспособности и чистоты клеточной популяции 4,5. Это требует баланса в методе пищеварения: сильное пищеварение необходимо для высвобождения клеток из ткани и получения достаточного количества клеток для последующих подходов, но жизнеспособность клеток будет негативно затронута, если пищеварение слишкомсильное 6,7. Кроме того, чистота клеточной популяции необходима для надежных результатов и точного анализа данных, который может быть выполнен с помощью FACS. Это подчеркивает важность оптимизации методов изоляции клеток для применения секвенирования следующего поколения к установленным моделям развития сосудов.
Хорошо охарактеризованной моделью для исследования развития сосудов является модель развития сосудов сетчатки мышей. Мышная сосудистая сетчатка развивается постнатально в двумерном поверхностном сплетении, с начальным ангиогенным прорастанием из зрительного нерва, видимым на постнатальный день (P)3, ангиогенным фронтом со стеблевыми и кончиковыми клетками и начальным созреванием сосудов, видимым при P6, и созреванием сосудистого сплетения, видимым после P9 8,9. Во время ремоделирования начального сосудистого сплетения эндотелиальные клетки подвергаются спецификации в отношении артериальных, капиллярных и венозных фенотипов в разных сосудах для создания кровеносной сети10,11. Таким образом, этот метод позволяет исследователям визуализировать формирование ангиогенного сосудистого сплетения и эндотелиальную артериально-венозную спецификацию и созревание в различные моменты времени во время развития9. Кроме того, данная модель предоставляет метод исследования влияния трансгенных манипуляций на ангиогенез и развитие сосудистого сплетения, который был применен для исследования развития сосудов, артериально-венозных мальформаций и кислород-индуцированной неоваскуляризации 12,13,14,15,16 . Чтобы объединить подходы секвенирования следующего поколения с моделью развития сосудов сетчатки мышей, необходим оптимизированный протокол выделения эндотелиальных клеток из ткани сетчатки.
Этот протокол описывает оптимизированный метод переваривания ткани сетчатки у мышей при Р6 для максимизации выхода клеток, чистоты и жизнеспособности. Ткань сетчатки выделяют у мышей P6, переваривают в течение 20 мин, иммунораступят для CD31 и CD45 и очищают через FACS для выделения одноклеточной суспензии эндотелиальных клеток примерно через 2,5 ч (рисунок 1A). Было обнаружено, что эти эндотелиальные клетки сохраняют высокую жизнеспособность в течение 60 мин после изоляции17, что позволяет подготовить библиотеку к методам секвенирования следующего поколения. Кроме того, репрезентативные результаты предоставляются для facS-мониторинга и результатов контроля качества двух отдельных методов секвенирования следующего поколения с использованием этого протокола изоляции: секвенирование РНК всего транскриптома и секвенирование одноклеточной РНК. Этот метод позволяет использовать подходы секвенирования следующего поколения в сочетании с моделью васкуляризации сетчатки для выяснения новых механизмов развития сосудов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Недавние улучшения в секвенировании следующего поколения расширили знания исследователей о молекулярной и клеточной биологии, а несколько исследований выявили новые парадигмы в сосудистой биологии. Применение этих методов к моделям развития сосудов требует оптимизации методов выделения клеток из эмбриональных и постнатальных тканей. Выход, жизнеспособность и чистота клеток должны быть максимальными, чтобы получить точные и воспроизводимые результаты от подходов к секвенированию следующего поколения. Модель васкуляризации сетчатки неонатальной мыши используется исследователями для изучения механизмов развития сосудов. Исследователи использовали эту модель для изучения механизмов ангиогенеза и спецификации артериально-венозной судьбы во время формирования и созревания кровеносных сосудов. Применение методов секвенирования следующего поколения для изучения модели развития сосудов сетчатки требует оптимизации метода выделения эндотелиальных клеток сетчатки, который максимизирует выход клеток, жизнеспособность и чистоту. Этот протокол описывает метод выделения, переваривания и очистки мышиной ткани сетчатки с использованием флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Результаты показывают, что очищенная FACS популяция CD31+/CD45-эндотелиальных клеток высоко обогащена экспрессией генов эндотелиальных клеток и не демонстрирует изменений жизнеспособности в течение 60 мин после FACS. Включены репрезентативные результаты подходов к секвенированию следующего поколения на эндотелиальных клетках, выделенных с использованием этого метода, включая объемное секвенирование РНК и секвенирование одноклеточной РНК, демонстрируя, что этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки совместим с приложениями секвенирования следующего поколения. Этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки позволит использовать передовые методы секвенирования для выявления новых механизмов развития сосудов.

Переваривание ткани сетчатки и иммуноокрашивание CD31 и CD45 приводит к идентифицируемой популяции CD31 + / CD45- эндотелиальных клеток после обнаружения клеток, отдельных клеток и жизнеспособности (рисунок 2A). Иммуноокрашивание CD45 требуется для устранения клеток CD31 + / CD45 +, кот?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Этот протокол описывает метод выделения мышиных постнатальных эндотелиальных клеток сетчатки, оптимизированных для выхода клеток, чистоты и жизнеспособности. Эти клетки подходят для подходов к секвенированию следующего поколения.

Выделение эндотелиальных клеток мышиной сетчатки для секвенирования следующего поколения

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Этот метод изоляции эндотелиальных клеток сетчатки позволит использовать передовые методы секвенирования для выявления новых механизмов развития сосудов. Описанный протокол оптимизирован для высоких степеней жизнеспособности и чистоты, которые необходимы для приложений секвенирования следующего поколения. Продемонстрировать процедуру будет Шелби Кейн, аспирант из лаборатории Херши.Начните удалять глаза у усыпленной неонатальной мыши, отрезав кожу и мембрану над глазом перпендикулярным разрезом века с помощью ножниц для рассечения. Затем используйте щипцы, чтобы надавить сверху и ниже глаза, чтобы глаз двигался из гнезда. Осторожно зажмите под глаз щипцами и перережьте зрительный нерв, который держит глаз прикрепленным.Затем поместите оба глаза мыши в колодец из 48-луночной тарелки в свежеприготовленный ледяной PBS до окончания сбора урожая. Чтобы изолировать ткань сетчатки мыши, подвешивайте глаза в подушечке для рассечения в чашке Петри, заполненной 500 микролитрами ледяного PBS, используя прокладку передаточной трубы с широким наконечником. Работая под рассеченным микроскопом, удерживайте зрительный нерв одним тонким щипцом и используйте вторые щипцы, чтобы проткнуть отверстие через переднюю камеру глаза, где соединяются роговица и склера.Затем разорвите отверстие по кругу примерно на 75% пути вокруг роговицы. Удерживая зрительный нерв одним щипцом, используйте вторые щипцы, чтобы аккуратно оторвать склеру и стекловидное тело от ткани сетчатки. Чтобы удалить сосуды хрусталика и гиалоидного сплетения, доберитесь до сетчатки открытыми щипцами, пока почти не коснитесь ее, а затем закройте щипцы, чтобы схватить и вытащить сосуды хрусталика и подъязычно-подвздошного сплетения из сетчатки.Когда все сосуды удалены, поместите сетчатку в двух миллилитровые микроцентрифужные трубки, заполненные 500 микролитрами одного x ледяного PBS. Удалите избыток PBS из двухмиллитровой микроцентрифужной трубки с помощью пипетки, оставив около 100 микролитров PBS в трубке, чтобы полностью покрыть ткань сетчатки. Затем добавьте в тюбик 500 микролитров свежеприготовленного раствора для пищеварения.Используйте пипетту P1000 и наконечник пипетки для пипетки вверх и вниз по ткани сетчатки в растворе для пищеварения пять раз. Когда это будет сделано, инкубируйте смесь для пищеварения на водяной бане с температурой 37 градусов цельсия в течение 20 минут с пипеткой смеси для пищеварения вверх и вниз каждые пять минут, как объяснялось ранее. После инкубации ткань сетчатки растворится в одноклеточную суспензию, делая смесь пищеварения мутной.Затем гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования удаляют PBS из промытой клеточной гранулы путем пипетирования, а затем иммунорафинируют клетки путем повторного использования гранулы в 100 микролитрах раствора для окрашивания антител на 0,5 раза 10 до шестых клеток. Инкубируйте одноклеточную суспензию с раствором для окрашивания антител в течение 30 минут на льду в темноте, постукивая по трубке каждые 10 минут, чтобы аккуратно перемешать клетки.Для флуоресцентно-активированной сортировки клеток гранулируют клетки центрифугированием при 375 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После удаления супернатанта промыть и гранулировать клетки в 500 микролитров PBS, как описано ранее. А затем повторно суспендировать ячейки в 300 микролитрах флуоресцентно-активированной сортировки клеток или буфера FACS, осторожно смешивая с пипеттой.Затем добавьте йодид пропидия или PI в качестве маркера жизнеспособности в пробирки, содержащие буфер FACS, чтобы получить конечную концентрацию 0,5 микрограмма на миллилитр. Используйте пипетку для переноса клеточных суспензий через защелкивающийся колпачок клеточного сетчатого фильтра, содержащий 35-микронный фильтр, в пятимиллилитровую пробирку. После фильтрации держите трубку FACS на льду в темноте, а затем перенесите трубку в сортировщик ячеек.Включите прибор FACS и компьютер и откройте программное обеспечение FACS для запуска и эксплуатации прибора FACS. Выполняйте регулярные тесты контроля качества. Загрузите контрольные образцы пятен в прибор FACS для регулировки осей.Начните с клеток только с антител IgG, чтобы генерировать и корректировать прямое рассеяние и боковое рассеяние. Затем антитело CD31 только для генерации и корректировки CD31. А затем антитело CD45 только для генерации и настройки CD45.Запишите данные из контрольных образцов. Затем загрузите окрашенные ячейки образца в инструмент FACS и запустите образец. Походка по ячейкам на основе параметров прямого рассеяния или FSC и бокового рассеяния или SSC.Клетки походки FSCA и FSCH для идентификации дублетов клеток и сбора только одиночных клеток. Клетки походки по PI и SSCA для идентификации жизнеспособных клеток. Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления Сделайте CD31+CD45-походку с элементами управления и походку по клеткам CD31 и CD45.Вставьте в прибор коллекторную трубку с 250 микролитрами буфера FACS. Затем начните сортировку ячеек, которые являются CD31 + CD45- в установленной коллекторной трубке. Храните сборные трубки на льду для дальнейшего анализа.Образцы могут быть обработаны для приложений секвенирования следующего поколения. В исследовании изменение времени пищеварения повлияло на выход клеток и процент жизнеспособности. Время пищеварения 20 минут привело к оптимальному выходу с низким процентом нежизнеспособных эндотелиальных клеток.Последующее окрашивание пропидия йодидом показало, что изолированные эндотелиальные клетки оставались жизнеспособными в течение 60 минут после выделения. Чистота клеточной популяции оценивалась с помощью количественного анализа ПЦР или qPCRR экспрессии генов эндотелиальных клеток, показывающего сильное обогащение генов эндотелиальных клеток в популяции CD31 + CD45. Очистка РНК из изолированных эндотелиальных клеток, преобразующих и усиливающих кДНК посредством подготовки библиотеки и секвенирования Библиотека кДНК привела к более чем 16 000 генов, идентифицированных в девяти независимых образцах.Падение транскриптов на миллион считываний или TPM наблюдалось в генах ниже этого порога. Секвенирование одноклеточной РНК изолированных эндотелиальных клеток сетчатки через 10-кратный конвейер геномики привело к медиане 1 171 гена на клетку, 15 247 обнаруженных генов и медиане 2 255 уникальных молекулярных идентификаторов или UMI на клетку в 917 клетках. Критическими шагами в этом протоколе являются изоляция ткани сетчатки и переваривание тканей, которые должны выполняться точно, как описано, для оптимизации выхода и жизнеспособности клеток.Изолированные эндотелиальные клетки могут быть использованы в передовых методах секвенирования, таких как секвенирование РНК цельного транскриптома, секвенирование одноклеточной РНК, секвенирование иммунопреципитации хроматина и анализ для транспозазного секвенирования хроматина. Использование этого оптимизированного метода в сочетании с методами секвенирования следующего поколения и вычислительными подходами может дополнительно прояснить механизмы взаимосвязанных сигнальных путей, которые регулируют развитие сосудов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Эффективное Вывод пигментного эпителия сетчатки клеток из стволовых клеток

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

Мышиные Кожные фибробластов Изоляция FACS

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Выделение мышиной эмбриональных кроветворных эндотелиальных клеток

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Изоляции клеток эндотелия прародителем от человеческой пуповинной крови

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Быстрое, режиссер дифференциация клеток эпителия сетчатки пигмента от человеческого эмбриона или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

В Vitro поколения Сомит производных от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Мультиплексный одноклеточной мРНК Секвенирование Анализ эмбриональных клеток мыши

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Подготовка малых РНК-библиотек для секвенирования ранних эмбрионов мыши

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Изоляция эндокардиальных и коронарных эндотелиальных клеток от вентрикулярной свободной стены Крысиного Сердца

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Изоляция murine сперматогенных клеток с помощью фиолетово-возбужденных клеток проницаемых ДНК Связывание красителя

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...