Name: isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing
Uploaded: 2021-10-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Yale Akış Sitometri Tesisi, Virginia Üniversitesi Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi, Yale Genomik Analiz Merkezi ve Virginia Üniversitesi Genom Analizi ve Teknoloji Çekirdeği'ne, sunulan deneylere katkıda bulunma konusundaki çabaları, uzmanlıkları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) ve K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) için NIH hibeleri ile finanse edilmiştir.

Yale Üniversitesi ve Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri, bu protokolde listelenen tüm hayvan deneylerini onayladı.
1. Retina izolasyonu için fare gözleri elde edin
<ol><li>1x buz gibi soğuk PBS hazırlayın ve 48 delikli bir plakanın her bir oluğuna 500 μL ekleyin.</li>
	<li>Yenidoğan fareleri doğum sonrası altıncı günde (P6) onaylanmış kurumsal kılavuzlara göre ötenazileştirin. Bu deney için, yaklaşık 4-8 yenidoğan...

<ol>
	<li>Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+next-generation+sequencing+technologies.">Overview of next-generation sequencing technologies.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+in+vascular+biology.">Single cell analysis in vascular biology.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).</li><li>Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+RNA+sequencing+to+study+vascular+diversity+and+function.">Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function.</a> Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).</li><li>Potter, A. S., Potter, S. S., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissociation+of+tissues+for+single-cell+analysis.">Dissociation of tissues for single-cell analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).</li><li>Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+handling+and+dissociation+for+single-cell+RNA-seq.">Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq.</a> Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).</li><li>Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+reveals+dissociatin-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations.">Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li><li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells.">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).</li><li>Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vascular+development+in+the+mouse+retina.">Characterization of vascular development in the mouse retina.</a> Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).</li><li>Crist, A., Young, C., Meadows, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+arteriovenous+identity+in+the+developing+neonate+mouse+retina.">Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).</li><li>dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterial+versus+venous+endothelial+cells.">Arterial versus venous endothelial cells.</a> Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).</li><li>Fang, J. S., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+regulation+of+arteriovenous+endothelial+cell+specification.">Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification.</a> F1000Res. 8, (2019).</li><li>Smith, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen-induced+retinopathy+in+the+mouse.">Oxygen-induced retinopathy in the mouse.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).</li><li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice.">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li><li>Ruiz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+hereditary+hemorrhagic+telangiectasia+generated+by+transmammary-delivered+immunoblocking+of+BMP9+and+BMP10.">A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10.</a> Scientific Reports. 6, 37366 (2016).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Ola, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+prevents+flow+induced+arterial-venous+malformations+by+inhibiting+Casein+Kinase+2.">SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2.</a> Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).</li><li>Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+highly+purified+and+viable+retinal+endothelial+cells.">Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells.</a> Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).</li><li>Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Considerations+for+the+control+of+background+fluorescence+in+clinical+flow+cytometry.">Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry.</a> Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).</li><li>Bachman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse-transcription+PCR+(RT-PCR).">Reverse-transcription PCR (RT-PCR).</a> Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+RNA+by+real-time+Reverse+Transcription-Polymerase+Chain+Reaction+(RT-PCR).">Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).</a> Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).</li><li>Liu, L., Shi, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD31:+beyond+a+marker+for+endothelial+cells.">CD31: beyond a marker for endothelial cells.</a> Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).</li><li>Zarkada, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+endothelial+tip+cells+guide+neuroretina+vascularization+and+blood-retina-barrier+formation.">Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation.</a> Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).</li><li>Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+murine+retinal+endothelial+cells.">Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells.</a> Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).</li><li>Benedito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+notch+ligands+Dll4+and+Jagged1+have+opposing+effects+on+angiogenesis.">The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis.</a> Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).</li><li>Daneman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt/beta-catenin+signaling+is+required+for+CNS,+but+not+non-CNS,+angiogenesis.">Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).</li><li>Okabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurons+limit+angiogenesis+by+titrating+VEGF+in+retina.">Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina.</a> Cell. 159 (3), 584-596 (2014).</li><li>Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+deficiency+of+Smad4+causes+arteriovenous+malformations:+a+mouse+model+of+Hereditary+Hemorrhagic+Telangiectasia.">Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia.</a> Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).</li><li>Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SMAD4+deficiency+leads+to+development+of+arteriovenous+malformations+in+neonatal+and+adult+mice.">SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).</li><li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+TGFbeta+signaling+in+retinal+microglia+induces+retinal+degeneration+and+exacerbates+choroidal+neovascularization.">Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization.</a> eLife. 8, 42049 (2019).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arterialization+requires+the+timely+suppression+of+cell+growth.">Arterialization requires the timely suppression of cell growth.</a> Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).</li><li>Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sonic+hedgehog+and+vascular+endothelial+growth+factor+act+upstream+of+the+Notch+pathway+during+arterial+endothelial+differentiation.">sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation.</a> Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).</li><li>Larrivee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALK1+signaling+inhibits+angiogenesis+by+cooperating+with+the+Notch+pathway.">ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway.</a> Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).</li><li>Wythe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ETS+factors+regulate+Vegf-dependent+arterial+specification.">ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification.</a> Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).</li><li>Davis, D. M., Purvis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+analysis+of+signaling+patterns+in+single+cells.">Computational analysis of signaling patterns in single cells.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).</li><li>Gaudet, S., Miller-Jensen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+signaling+pathways+with+an+expanding+single-cell+toolbox.">Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox.</a> Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).</li><li>Aibar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCENIC:+single-cell+regulatory+network+inference+and+clustering.">SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering.</a> Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+and+regulators+of+cell+fate+decisions+are+revealed+by+pseudotemporal+ordering+of+single+cells.">The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells.</a> Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).</li></ol>

Bu protokol, endotel hücrelerinin doğum sonrası murin retina dokusundan izole edilmesi için yüksek hücre sayısı, saflık ve canlılık için optimize edilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Hücre saflığı, endotel hücre popülasyonlarının CD31+/CD45- immün boyama ile sindirilmiş tek hücreli süspansiyondan FACS izolasyonu ile elde edilir. İzolasyon kalitesi, CD31, CD45 ve VE-Cadherin için qPCR ile Trypan mavi boyama ve gen ekspresyonu ile canlılık testlerinde ölçülür (VE-Cadherin immün boyama i...

Nükleik asitlerin yeni nesil dizileme yaklaşımlarıyla dizilenmesinin yüksek verim kapasitesi, araştırmacıların moleküler ve hücresel biyoloji hakkındaki bilgilerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu ileri teknikler arasında tüm transkriptom RNA dizilimi, Tek Nükleotid Polimorfizmlerini (SNP'ler) tanımlamak için hedeflenen bölgelerin DNA dizilimi, Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) dizilemesinde bağlı transkripsiyon faktörlerinin DNA dizilimi veya Transpozaz Erişilebilir Kromatin (ATAC) dizilimi için Tahlilde açık kromatin bölgeleri ve tek hücreli RNA dizilimi1 . Vasküler biyolojide, bu ilerlemeler, araştırmacıların karmaşık gelişim ve hastalık mekanizmalarını aydınlatmalarına ve değişen fenotiplerin 2,3'ünün bir sürekliliği boyunca gen ekspresyon kalıplarını ayırt etmelerine izin vermiştir. Gelecekteki deneyler, yeni nesil dizilemeyi değerlendirilmiş vasküler gelişim modelleriyle birleştirerek karmaşık mekanizmaları daha da tanımlayabilir, ancak numune hazırlama yöntemlerinin gelişmiş dizileme teknikleriyle uyumlu olması gerekir.
Yeni nesil dizileme yaklaşımlarının kalitesi, doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, numune hazırlama yöntemine bağlıdır. Hücrelerin bir alt kümesini izole ederken veya dokulardan tek hücreli süspansiyonlar oluştururken, hücre sayısını, canlılığını ve hücre popülasyonunun saflığını en üst düzeye çıkarmak için optimal sindirim ve saflaştırma yöntemleri gereklidir 4,5. Bu, sindirim yönteminde bir denge gerektirir: hücreleri dokudan serbest bırakmak ve aşağı akış yaklaşımları için yeterli hücre elde etmek için güçlü sindirim gereklidir, ancak sindirim çok güçlüyse hücre canlılığı olumsuz yönde etkilenecektir 6,7. Ek olarak, hücre popülasyonunun saflığı, FACS aracılığıyla gerçekleştirilebilecek sağlam sonuçlar ve verilerin doğru analizi için gereklidir. Bu, yerleşik vasküler gelişim modellerine yeni nesil dizileme uygulamak için hücre izolasyon yöntemlerini optimize etmenin önemini vurgulamaktadır.
Vasküler gelişimi araştırmak için iyi karakterize edilmiş bir model murin retinal vasküler gelişim modelidir. Murin retinal vaskülatür, postnatal günde (P)3 görülebilen optik sinirden ilk anjiyojenik filizlenme, sap ve uç hücreleri ile anjiyojenik ön ve P6'da görülebilen ilk damar olgunlaşması ve P9 8,9'dan sonra görülebilen vasküler pleksus olgunlaşması ile postnatal olarak iki boyutlu yüzeysel pleksusta gelişir. İlk vasküler pleksusun yeniden şekillendirilmesi sırasında, endotel hücreleri, dolaşım ağı10,11 oluşturmak için farklı damarlardaki arteriyel, kılcal ve venöz fenotiplere doğru spesifikasyona tabi tutulur. Bu nedenle, bu yöntem araştırmacıların anjiyojenik vasküler pleksus oluşumunu ve endotelyal arteriyel-venöz spesifikasyonu ve olgunlaşmayı gelişim sırasında çeşitli zaman noktalarında görselleştirmelerini sağlar9. Ek olarak, bu model transgenik manipülasyonun anjiyogenez ve vasküler pleksus gelişimi üzerindeki etkilerini araştırmak için vasküler gelişim, arteriyel-venöz malformasyonlar ve oksijene bağlı neovaskülarizasyonun araştırılması için uygulanan bir yöntem sunmaktadır 12,13,14,15,16 . Yeni nesil dizileme yaklaşımlarını murin retinal vasküler gelişim modeli ile birleştirmek için, endotel hücrelerinin retina dokusundan izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol gereklidir.
Bu protokol, hücre verimini, saflığını ve canlılığını en üst düzeye çıkarmak için P6'daki farelerden retina dokusunu sindirmek için optimize edilmiş bir yöntemi açıklar. Retina dokusu P6 farelerden izole edilir, 20 dakika boyunca sindirilir, CD31 ve CD45 için immünoboyalıdır ve endotel hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonunu yaklaşık 2.5 saatte izole etmek için FACS ile saflaştırılır (Şekil 1A). Bu endotel hücrelerinin, izolasyon sonrası60 dakika boyunca yüksek canlılığı koruduğu bulundu 17 ve yeni nesil dizileme yöntemleri için kütüphane hazırlıklarına izin verdi. Ek olarak, bu izolasyon protokolünü kullanan iki ayrı yeni nesil dizileme yönteminden FACS geçit ve kalite kontrol sonuçları için temsili sonuçlar sağlanmaktadır: tüm transkriptom RNA dizilimi ve tek hücreli RNA dizilimi. Bu yöntem, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını aydınlatmak için retinal vaskülarizasyon modeli ile birlikte yeni nesil dizileme yaklaşımlarının kullanılmasına izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2 mL Eppendorf&#160;safe-lock tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>4036-3352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Non TC-treated Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat Anti-Mouse CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>551262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Rat IgG2a &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSChorus Software</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCHORUS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSMelody Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSMELODY</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>234115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A2494001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Graduated Transfer Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-711-9AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Pan Wax</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>629100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14085-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Stereo Microscope M165 FC</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf&#160;Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>22364120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine dissection forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11250-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane, USP</td>
			<td>Covetrus</td>
			<td>11695067772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FSGPD20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Forward: 5&#8217;- agagggaaatcgtgcgtgac -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: ActB_Reverse: 5&#8217;- caatagtgatgacctggccgt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Forward: 5&#8217;- gagcccaatcacgtttcagttt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD31_Reverse: 5&#8217;- tccttcctgcttcttgctagct -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Forward: 5&#8217;- gggttgttctgtgccttgtt -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: CD45_Reverse: 5&#8217;- ctggacggacacagttagca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Forward: 5&#8217;- tcctctgcatcctcactatcaca -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5&#8217;- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3&#8217;</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plus Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>75002477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>172-5120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat Anti-Mouse CD45</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V450 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560457</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine retinal endothelial cells for next-generation sequencing

Yeni nesil dizilemedeki son gelişmeler, araştırmacıların moleküler ve hücresel biyoloji hakkındaki bilgilerini ilerletmekte olup, vasküler biyolojide yeni paradigmaları ortaya koyan çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bu yöntemlerin vasküler gelişim modellerine uygulanması, embriyonik ve postnatal dokulardan hücre izolasyon tekniklerinin optimizasyonunu gerektirir. Hücre verimi, canlılığı ve saflığı, yeni nesil dizileme yaklaşımlarından doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için maksimum olmalıdır. Yenidoğan faresi retinal vaskülarizasyon modeli, araştırmacılar tarafından vasküler gelişim mekanizmalarını incelemek için kullanılır. Araştırmacılar bu modeli, kan damarı oluşumu ve olgunlaşması sırasında anjiyogenez mekanizmalarını ve arteriyel-venöz kader spesifikasyonunu araştırmak için kullandılar. Retinal vasküler gelişim modelini incelemek için yeni nesil dizileme tekniklerinin uygulanması, retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için hücre verimini, canlılığını ve saflığını en üst düzeye çıkaran bir yöntemin optimizasyonunu gerektirir. Bu protokol, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak murin retinal doku izolasyonu, sindirim ve saflaştırma için bir yöntemi açıklar. Sonuçlar, FACS-saflaştırılmış CD31 + / CD45- endotel hücre popülasyonunun endotel hücre gen ekspresyonu için oldukça zenginleştirildiğini ve FACS'tan sonra 60 dakika boyunca canlılıkta bir değişiklik göstermediğini göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak izole edilen endotel hücreleri üzerinde, toplu RNA dizilimi ve tek hücreli RNA dizilimi de dahil olmak üzere, yeni nesil dizileme yaklaşımlarının temsili sonuçları, retinal endotel hücre izolasyonu için bu yöntemin yeni nesil dizileme uygulamalarıyla uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu retinal endotel hücre izolasyonu yöntemi, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını ortaya çıkarmak için ileri dizileme tekniklerine izin verecektir.

CD31 ve CD45 için retina dokusunun sindirimi ve immünoboyama, hücreler, tek hücreler ve canlılık için geçişten sonra CD31 + / CD45 endotel hücrelerinin tanımlanabilir bir popülasyonu ile sonuçlanır (Şekil 2A). CD45 immün boyaması, trombositleri ve bazı lökositleri içeren CD31 + / CD45 + hücrelerini ortadan kaldırmak için gereklidir21. Her deneyde antikor özgüllüğünü göstermek ve geçiş stratejisini yönlendirmek için kontroller yapılma...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing at JoVE.com

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Bu retinal endotel hücre izolasyonu yöntemi, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını ortaya çıkarmak için ileri dizileme tekniklerine izin verecektir. Açıklanan protokol, yeni nesil dizileme uygulamaları için gerekli olan yüksek derecede canlılık ve saflık için optimize edilmiştir. Prosedürü gösteren, Hershey Laboratuvarı'ndan yüksek lisans öğrencisi olan Shelby Cain olacak.Diseksiyon makası kullanarak göz kapağına dik bir kesi ile göz üzerindeki cildi ve zarı keserek ötenazi yenidoğan faresinden gözleri çıkarmaya başlayın. Ardından, gözün soketten dışarı çıkması için gözün üstüne ve altına bastırmak için forsepsleri kullanın. Forseps ile gözün altına dikkatlice sıkıştırın ve gözü bağlı tutan optik siniri kesin.Ardından, farenin her iki gözünü de hasat bitene kadar taze hazırlanmış buz gibi PBS'deki 48 delikli plakanın bir kuyucuğuna yerleştirin. Fare retina dokusunu izole etmek için, diseksiyon pedindeki gözleri, geniş uçlu bir transfer borusu pedi kullanarak 500 mikrolitre buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş bir Petri kabında askıya alın. Diseksiyon mikroskobu altında çalışırken, optik siniri bir ince forseps ile tutun ve ikinci forsepsleri, kornea ve skleranın bağlandığı gözün ön odasından deliği delmek için kullanın.Daha sonra deliği, korneanın etrafındaki yolun yaklaşık% 75'inde bir daire içinde yırtın. Optik siniri bir forseps ile tutarken, sklerayı ve vitreus gövdesini retina dokusundan nazikçe yırtmak için ikinci forsepsleri kullanın. Lens ve hyaloid pleksus damarlarını çıkarmak için, neredeyse dokunana kadar açık forseps ile retinaya ulaşın ve ardından lensi ve hyaloid pleksus damarlarını retinadan tutup çekmek için forsepsleri kapatın.Tüm damarlar çıkarıldığında, retinaları 500 mikrolitre bir x buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş iki mililitrelik mikro santrifüj tüplerine yerleştirin. Retina dokusunu tamamen örtmek için tüpte yaklaşık 100 mikrolitre PBS bırakan bir pipetle iki mililitrelik mikro santrifüj tüpünden fazla PBS'yi çıkarın. Daha sonra tüpe taze hazırlanmış sindirim çözeltisinden 500 mikrolitre ekleyin.Sindirim solüsyonundaki retina dokusunu beş kez yukarı ve aşağı pipetlemek için bir P1000 pipet ve pipet ucu kullanın. Tamamlandığında, sindirim karışımını 37 santigrat derecelik bir su banyosunda 20 dakika boyunca inkübe edin ve sindirim karışımını daha önce açıklandığı gibi her beş dakikada bir yukarı ve aşağı pipetleyin. Kuluçkadan sonra, retina dokusu tek bir hücre süspansiyonunda çözülecek ve sindirim karışımını bulanıklaştıracaktır.Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 375g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Santrifüjlemeyi takiben, PBS'yi yıkanmış hücre peletinden pipetle çıkarın ve daha sonra peleti altıncı hücrelere 0.5 kez 10 başına 100 mikrolitre antikor boyama çözeltisi içinde yeniden askıya alarak hücreleri immünostain. Tek hücreli süspansiyonu, hücreleri nazikçe karıştırmak için her 10 dakikada bir tüpe dokunarak karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca antikor boyama çözeltisi ile inkübe edin.Floresan ile aktive edilen hücre sıralama için, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 375g'de santrifüjleme yoluyla pelet edin. Süpernatan çıkarıldıktan sonra, hücreleri daha önce tarif edildiği gibi 500 mikrolitre PBS'de yıkayın ve toplayın. Daha sonra pipetta ile nazikçe karıştırarak hücreleri 300 mikrolitre floresan ile aktive edilmiş hücre ayıklama veya FACS tamponunda yeniden askıya alın.Daha sonra, mililitre başına 0.5 mikrogramlık bir son konsantrasyon elde etmek için FACS tamponunu içeren numune tüplerine bir canlılık belirteci olarak propidium iyodür veya PI ekleyin. Hücre süspansiyonlarını, 35 mikronluk bir filtre içeren bir hücre süzgeci çıtçıtlı kapağından beş mililitrelik bir test tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Filtrelemeden sonra, FACS tüpünü karanlıkta buz üzerinde tutun ve ardından tüpü hücre sıralayıcısına aktarın.FACS cihazını ve bilgisayarı açın ve FACS cihazını çalıştırmak ve çalıştırmak için FACS yazılımını açın. Rutin kalite kontrol testleri yapın. Eksenleri ayarlamak için kontrol lekesi numunelerini FACS cihazına yükleyin.İleriye doğru saçılma ve yan saçılma oluşturmak ve ayarlamak için sadece IgG antikoru hücreleri ile başlayın. Daha sonra CD31 antikoru sadece CD31 üretmek ve ayarlamak için. Ve sonra CD45 antikoru sadece CD45 üretmek ve ayarlamak için.Denetim örneklerinden verileri kaydedin. Ardından, lekeli numune hücrelerini FACS cihazına yükleyin ve numuneyi çalıştırın. Hücreleri ileri saçılma veya FSC ve yan saçılma veya SSC parametrelerine göre yürüyün.FSCA ve FSCH tarafından hücre çiftlerini tanımlamak ve sadece tek hücreleri toplamak için yürüyüş hücreleri. Canlı hücreleri tanımlamak için PI ve SSCA ile yürüyüş hücreleri. Kontrollerle CD31 + CD45 yürüyüşü yapın Kontrollerle CD31 + CD45 yürüyüşü yapın ve hücreleri CD31 ve CD45 ile yürüyün.Cihaza 250 mikrolitre FACS tamponu içeren bir toplama tüpü yerleştirin. Ardından, CD31+CD45 olan hücreleri yüklü toplama tüpüne sıralamaya başlayın. Daha fazla analiz için toplama tüplerini buz üzerinde tutun.Numuneler yeni nesil dizileme uygulamaları için işlenebilir. Çalışmada, sindirim süresinin değiştirilmesi hücre verimini ve canlılık yüzdesini etkiledi. 20 dakikalık sindirim süresi, düşük oranda canlı olmayan endotel hücreleri ile optimal bir verim ile sonuçlandı.Daha sonraki propidium iyodür boyaması, izole endotel hücrelerinin izolasyondan sonra 60 dakika boyunca canlı kaldığını göstermiştir. Hücre popülasyonu saflığı, CD31 + CD45 popülasyonundaki endotel hücre genleri için güçlü zenginleştirme gösteren endotel hücre genlerinin ekspresyonunun kantitatif PCR veya qPCRR analizi ile değerlendirildi. İzole endotel hücrelerinden RNA'nın saflaştırılması ve kütüphane hazırlama ve dizileme yoluyla cDNA'yı dönüştürmesi ve yükseltmesi cDNA kütüphanesi, dokuz bağımsız örnekte tanımlanan 16.000'den fazla gen ile sonuçlandı.Bu eşiğin altındaki genlerde milyon okuma veya TPM başına transkriptlerde bir düşüş gözlendi. İzole edilmiş retinal endotel hücrelerinin 10x Genomik boru hattı boyunca tek hücreli RNA dizilimi, hücre başına 1.171 gen, tespit edilen 15.247 genin medyanı ve 917 hücrede hücre başına 2.255 benzersiz moleküler tanımlayıcı veya UMI sayımının medyanı ile sonuçlandı. Bu protokoldeki kritik adımlar, hücre verimini ve canlılığını optimize etmek için tarif edildiği gibi doğru bir şekilde yapılması gereken retinal doku izolasyonu ve doku sindirimidir.İzole endotel hücreleri, tüm transkriptom RNA dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi, kromatin immünopresipitasyon dizilimi ve transpozaz erişimli kromatin dizilimi için tahlil gibi gelişmiş dizileme tekniklerinde kullanılabilir. Bu optimize edilmiş yöntemin yeni nesil dizileme yöntemleriyle ve hesaplamalı yaklaşımlarla birlikte kullanılması, vasküler gelişmeleri düzenleyen birbirine bağlı sinyal yollarının mekanizmalarını daha da açıklığa kavuşturabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Murine Dermal Fibroblast Isolation by FACS

FACS ile Murin Dermal fibroblast İzolasyonu

Fibroblasts are the principle cell type responsible for secreting extracellular matrix and are a critical component of many organs and tissues. Fibroblast ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

Yalıtım endotelyal Progenitor Hücre insan göbek kordon kanı

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Fare Embriyonik Hücrelerinin Çok katlı Tek Hücreli mRNA Sıralama Analizi

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Erken Fare Embriyolarından Sıralama için Küçük RNA Kütüphanelerinin Hazırlanması

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

Endokardiyal ve Koroner Endotel Hücrelerinin Sıçan Kalbinin Ventriküler Serbest Duvarından İzolasyon

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolation of Murine Spermatogenic Cells using a Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon

Isolation of meiotic spermatocytes is essential to investigate molecular mechanisms underlying meiosis and spermatogenesis. Although there are established ...