Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NINDS R01 NS105005 (KRG) و NS105005-03S1 (KRG) ، وزارة الدفاع USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG) ، NIAAA R01AA016852 ، NIAAA T32AA007565 (CFH) ، ومنحة من FRAXA Research (CFH) وجمعية الزهايمر ، AARG-NTF-21-852843 (KRG) ، AARF-19-614794-RAPID (KRG).

تم عزل الخلايا والأنسجة عن الحيوانات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمعتمد من قبل لجنة ويك فورست المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على العينات التي تمت معالجتها بالفعل وتثبيتها وفقا لنماذج ومتطلبات تجريبية محدد...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn هو فحص سريع يستخدم مقايسة ربط القرب للكشف عن البروتينات داخل 40 نانومتر من بعضها البعض ، مما يسمح بالكشف عن تكوين المشبك. تعمل هذه التقنية على تحسين اختبارات الفلورسنت الحالية ، والتي تعمل فقط كقياسات بديلة لتشكيل المشبك العصبي. يكتشف DetectSyn التغيرات القابلة للقياس الكمي في البروتينات...

نقاط الاشتباك العصبي هي الوحدة الأساسية للتواصل بين الخلايا العصبية1. العديد من نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا العصبية داخل نفس المناطق تؤدي إلى دوائر تتوسط السلوك2. تتكون المشابك العصبية من طرف ما قبل المشبكي من خلية عصبية واحدة تطلق ناقلات عصبية أو ببتيدات نيوروببتيدات تنقل المعلومات إلى مستقبلات ما بعد المشبكي لخلية عصبية أخرى. يحدد جمع الإشارات قبل المشبكي ما إذا كانت الخلايا العصبية ما بعد المشبكي ستطلق إمكانات عمل وتنشر الرسالة إلى الخلايا العصبية الأخرى.
ينشأ علم الأمراض المشبكي ، وهو انهيار نقاط الاشتباك العصبي ، في الأمراض والاضطرابات التي تتميز بانخفاض الحجم العصبي ، مثل مرض الزهايمر والاضطراب الاكتئابي الرئيسي ، مما يؤدي إلى دوائر لم تعد تؤدي على النحو الأمثل3،4،5. من المحتمل أن تكون استعادة كثافة المشبك الداخلي وراء فعالية العلاجات المحتملة لهذه الاضطرابات. على سبيل المثال ، ثبت مؤخرا أن زيادة نقاط الاشتباك العصبي تكمن وراء الفعالية السلوكية لمضادات الاكتئاب السريعة6. لفحص علاجات التشابك العصبي المحتملة بسرعة، يحتاج الباحثون إلى تقنيات تحدد بسرعة التغييرات في أرقام المشبك العصبي.
المنهجيات الحالية إما مستهلكة للوقت ومكلفة (المجهر الإلكتروني ، التصوير المقطعي المصفوفي) ، أو أنها تدرس فقط التغيرات ما بعد المشبكي دون دمج المشاركة قبل المشبكي (تحليلات العمود الفقري ، التألق المناعي / التوطين المشترك). تساعد الأصباغ مثل DiI أو البروتينات الفلورية مثل GFP على تصور الخلايا العصبية وتوصيف العمود الفقري بعد المشبكي. ومع ذلك ، يستخدم تحليل العمود الفقري النسب التي يحددها الباحث لتحديد المورفولوجيا ، والتي يمكن أن تقلل من قابلية التكاثر7. علاوة على ذلك ، لا يزال يتم الكشف عن كيفية ارتباط فئات العمود الفقري المختلفة بالمشابك الوظيفية8. يمكن أن يكون تكوين العمود الفقري عابرا وقد يعكس اللدونة ما بعد المشبكي ، ولكن يمكن القضاء على هذه العمود الفقري قبل الاستقرار في مشبك عصبي مع خلية عصبية ما قبل المشبكي9.
يوفر التوطين المشترك وكيلا أفضل للمشابك العصبية من تحليل العمود الفقري لأنه يمكن للمرء أن يصبغ المناعة للبروتينات قبل المشبكي وما بعد المشبكي. ومع ذلك ، قد تنتج البروتينات المشبكية قيم توطين مشتركة منخفضة لأن البروتينات متجاورة وقد لا تتداخل باستمرار. وبالتالي ، نظرا لأن البروتينات ليست متراكبة بالكامل ، فقد لا تقيس تقنيات التوطين المشترك بدقة التغييرات في تكوين المشبك العصبي بسبب هذه المعلومات المفقودة. أخيرا ، على الرغم من أن كل من المجهر الإلكتروني (EM) والتصوير المقطعي المصفوفي يوفران صورا عالية الدقة للمشابك العصبية ، إلا أنهما يستهلكان وقتا طويلا. يتطلب EM أيضا معدات متخصصة ، ويقتصر الباحثون على كميات صغيرة من الأنسجة لأي تجربة معينة. في حين أن التصوير المقطعي بالصفيف يوفر بأناقة القدرة على فحص العديد من البروتينات على أقسام رقيقة للغاية ويمكن دمجها مع EM10 ، فقد تكون هذه التقنية كثيفة العمالة للغاية وتتجاوز نطاق التجارب التي تحتاج إلى المسح السريع بحثا عن التغييرات في تكوين المشبك.
DetectSyn هو تطبيق محدد لفحص ربط القرب Duolink. يسمح فحص PLA بالكشف العام عن التفاعلات بين البروتين والبروتين. يقوم DetectSyn بسد المقاييس الوكيلة لما بعد المشبكي عن طريق تضخيم إشارة الفلورسنت المنبعثة من البروتينات الموسومة قبل وبعد المشبكي في غضون 40 نانومتر من بعضها البعض. إذا كانت البروتينات المشبكية في حدود 40 نانومتر ، كما هو الحال داخل شق متشابك ، فإن الأجسام المضادة الثانوية ، التي تحتوي على مجسات الحمض النووي ، سوف تهجن إلى حمض نووي دائري. يعبر هذا الحمض النووي الدائري الهجين عن مسبار فلورسنت ، يتم تضخيمه واكتشافه باستخدام تقنيات الفحص المجهري الفلوري القياسية (انظر الشكل 1). والأهم من ذلك، على عكس التصوير المقطعي الكهرومغناطيسي والتصوير المقطعي المصفوفي، أن هذه التقنية لا تتطلب معدات متخصصة وتستغرق نفس الوقت تقريبا مثل الكيمياء النسيجية المناعية القياسية. وبالتالي ، فإن إمكانية الوصول إلى هذه التقنية تمكن الباحثين خارج المؤسسات كثيفة البحث من المشاركة في أبحاث علم الأمراض العصبي. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه التقنية فحص التغيرات في كثافة المشبكية في مناطق دماغية متعددة ضمن تجربة واحدة ، مما يوفر تمثيلا أكثر شمولية للتغيرات المشبكية بسبب المرض أو العلاج.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

نقاط الاشتباك العصبي هي موقع التواصل بين الخلايا العصبية. ترتبط قوة الدائرة العصبية بالكثافة المشبكية ، وانهيار نقاط الاشتباك العصبي هو سمة من سمات الحالات المرضية مثل الاضطراب الاكتئابي الرئيسي (MDD) ومرض الزهايمر. تشمل التقنيات التقليدية للتحقيق في أعداد المشبك التعبير الجيني لعلامات الفلورسنت (على سبيل المثال ، بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)) ، والأصباغ التي تملأ الخلايا العصبية (على سبيل المثال ، صبغة الكربوسيانين ، DiI) ، والكشف عن الفلورسنت المناعي لعلامات العمود الفقري (على سبيل المثال ، كثافة ما بعد المشبكي 95 (PSD95)). أحد التحذيرات الرئيسية لهذه التقنيات الوكيلة هو أنها تحدد فقط التغييرات ما بعد المشبكية. ومع ذلك ، فإن المشبك هو اتصال بين محطة ما قبل المشبكي والعمود الفقري ما بعد المشبكي. يتطلب المعيار الذهبي لقياس تكوين / إزالة المشبك الداخلي إجراء مجهر إلكتروني مستهلك للوقت أو تقنيات التصوير المقطعي المصفوفي. وتتطلب هذه التقنيات تدريبا متخصصا ومعدات مكلفة. علاوة على ذلك ، يمكن تقييم عدد محدود فقط من الخلايا العصبية واستخدامها لتمثيل التغييرات في منطقة الدماغ بأكملها. DetectSyn هي تقنية فلورسنت سريعة تحدد التغييرات في تكوين المشبك العصبي أو القضاء عليه بسبب حالة مرضية أو نشاط دوائي. يستخدم DetectSyn مقايسة ربط القرب السريع للكشف عن البروتينات المتجاورة قبل وبعد المشبكي والمجهر الفلوري القياسي ، وهي تقنية متاحة بسهولة لمعظم المختبرات. يسمح الكشف الفلوري عن الثقب الناتج بتحليل سريع وغير متحيز للتجارب. يوفر DetectSyn نتائج أكثر تمثيلا من المجهر الإلكتروني لأنه يمكن تحليل مساحات أكبر من عدد محدود من الخلايا العصبية الفلورية. علاوة على ذلك ، يعمل DetectSyn على الخلايا العصبية المستزرعة في المختبر وشرائح الأنسجة الثابتة. أخيرا ، يتم توفير طريقة لتحليل البيانات التي تم جمعها من هذه التقنية. بشكل عام ، يقدم DetectSyn إجراء للكشف عن التغيرات النسبية في كثافة المشبك عبر العلاجات أو الحالات المرضية وهو أكثر سهولة من التقنيات التقليدية.

يتم تقديم البيانات المعدلة من Heaney et al.6 لإثبات تجربة يتوقع فيها زيادة تكوين المشبك العصبي (يرجى الاطلاع على6 لمزيد من المعلومات ومناقشة أكثر تعمقا للآلية). في السابق ، ثبت أن مضادات الاكتئاب السريعة تتطلب تنشيط مستقبلات التمثيل الغذائي المثبطة ، GABAB (النوع الفرعي ل...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn هو اختبار فلورسنت سريع وغير متحيز يقيس التغيرات في عدد المشبك النسبي (المشاركة قبل وبعد المشبكي) عبر العلاجات أو الحالات المرضية. تستخدم هذه التقنية تقنية ربط القرب التي يمكن استخدامها في كل من الخلايا العصبية المستزرعة والأنسجة الثابتة.

DetectSyn: طريقة فلورسنت سريعة وغير متحيزة للكشف عن التغيرات في كثافة المشبك

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

يستفيد DetectSyn من تقنية مقايسة ربط القرب لتحديد التغييرات التي تطرأ على نقاط الاشتباك العصبي بسرعة. كما نقدم بروتوكولا لتحليل النتائج. الميزة الرئيسية ل DetectSyn هي مدى سرعة الحصول على النتائج في المناطق الكبيرة من الأنسجة التي يمكن تحليلها.للبدء ، قم بإزالة محلول الحجب بعناية باستخدام ماصة باستور بلاستيكية دون إزعاج الخلايا. ثم قم بخط طبق بتري بلاستيكي كبير مع Parafilm. وباستخدام الملقط ، انقل زلات الغطاء بعناية إلى Parafilm.أضف 60 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي إلى الجزء العلوي من زلة الغطاء ، مما يضمن عدم تسرب محلول الأجسام المضادة على جانبي انزلاق الغطاء. لتوفير الرطوبة ومنع العينات من الجفاف أثناء الحضانة ، أضف الماء فائق النقاء إلى طبق بتري أصغر ، وضع الطبق بعناية حول زلات الغطاء. ثم قم بتغطية طبق بتري الأكبر حجما واحتضن الخلايا المستزرعة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.بعد الحضانة مع الجسم المضاد الأساسي ، استخدم الملقط للاستفادة بعناية من محلول الأجسام المضادة الأساسي من الغطاء ينزلق على منشفة ورقية ونقل زلات الغطاء إلى صفيحة 24 بئر الأصلية المليئة ب 500 ميكرولتر من PBS. ثم اغسل العينات باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها بإثارة لطيفة على شاكر مداري. بعد الغسيل الأخير ، انقل الغطاء مرة أخرى إلى طبق بتري الكبير وأضف 40 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي إلى الجزء العلوي من زلة الغطاء.غطي طبق بتري واحتضني العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. للربط ، مع الحفاظ على الليغاز على كتلة باردة ، قم بتخفيف الليغاز من 1 إلى 40 باستخدام مخزون الربط وأضف على الفور 40 ميكرولتر من مزيج الليغاز إلى زلات الغطاء. غطي طبق بتري واحتضني العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.للتضخيم ، قم بتخفيف البوليميراز 1280 على كتلة باردة باستخدام مخزون التضخيم. ثم أضف 40 ميكرولتر من مزيج التضخيم إلى زلات الغطاء واحتضن العينات لمدة 100 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، للتركيب ، قم بإسقاط ثلاثة ميكرولترات من وسائط التركيب على شريحة.اضغط على المخزن المؤقت الزائد للغسيل من انزلاق الغطاء وضع الغطاء مع الخلايا التي تتجه لأسفل في وسائط التركيب. أغلق الجانبين بكمية صغيرة من طلاء الأظافر الشفاف لتثبيت الغطاء في مكانه. لتركيب شرائح الأنسجة ، انقل شريحة الأنسجة بعناية إلى الشريحة المعدة وضعها مسطحة.ثم قم بإسقاط 5 إلى 10 ميكرولترات من الوسائط المتصاعدة على شريحة الأنسجة. ضع غطاء زجاجي مزلقا فوق شريحة الأنسجة وأغلق الغطاء بطلاء أظافر شفاف ، كما هو موضح سابقا. بالنسبة للتصوير الرقمي باستخدام المجهر البؤري ، اضبط الكسب والإزاحة وطاقة الليزر لكل قناة فلورسنت لتقليل ضوضاء الخلفية وتعزيز إشارة الفلورسنت.تأكد من أن إشارة الفلورسنت ليست مشبعة. بالنسبة للخلايا العصبية المستزرعة ، ضمن علامة التبويب اكتساب ND ، انقر فوق حفظ في ملف. ثم ضمن استعراض، اختر ملفا لحفظ الصورة وإدخال اسم الملف.بعد ذلك، ضمن علامة التبويب Z، حدد خيار الوضع المتماثل المعرف بواسطة النطاق. اضبط التركيز على أفضل خريطة ذات مستويين وانقر على الزر نسبي لتعيين هذا المستوى البؤري في منتصف المكدس z. بعد ذلك ، اضبط النطاق على خمسة ميكرومترات بخطوات ميكرومتر واحدة وتحقق من إغلاق الغالق النشط أثناء حركة Z.ضمن علامة التبويب الطول الموجي ، حدد اسم الزر البصري مع إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا ضمن التكوين البصري وانقر فوق تشغيل الآن. بالنسبة للأنسجة المقطعة، اختر مسح الصورة الكبيرة ضوئيا من قائمة الاكتساب، ثم ضمن لوحة الالتقاط، حدد الزر البصري باستخدام إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا. أيضا ، حدد الهدف الصحيح في هذه اللوحة.بعد ذلك ، أسفل لوحة المنطقة وقطعة العين ، استخدم مفاتيح الأسهم لتعيين حدود المنطقة ذات الأهمية أو عائد الاستثمار. ثم انقر فوق حفظ صورة كبيرة في ملف وإنشاء اسم ملف مسار حفظ للصورة. أخيرا ، ضمن لوحة الإعداد ، تأكد من التحقق من الالتقاط متعدد القنوات.ثم اختر اسم الزر البصري مع إعدادات الاكتساب التي تم تكوينها مسبقا ضمن التكوين البصري. في ImageJ ، افتح خيار العتبة بالانتقال إلى قائمة الصورة ، والنقر فوق ضبط ، ثم العتبة. اختر خيار الخلفية الداكنة إذا كانت الصورة تحتوي على خلفية داكنة.بعد ذلك ، اضبط الحدود العليا والسفلية للعتبة لكل إعدادات عتبة محسنة تم تحديدها مسبقا وانقر فوق تطبيق. بالنسبة للخلايا المستزرعة ، استخدم قناة MAP2 وأداة عائد استثمار يدوي حر لرسم عائد استثمار لكل خلية عصبية ، بما في ذلك التشعبات و soma. بالنسبة للأنسجة المقطعة، ارسم عائد استثمار حر داخل صورة الشريحة التي تغلف منطقة الاهتمام.ثم احصل على مساحة عائد الاستثمار عن طريق فتح قائمة التحليل والنقر فوق قياس. للكشف عن عدد البونتا داخل كل عائد استثمار ، استخدم أداة اكتشاف تلقائية مثل تحليل الجسيمات. من القائمة تحليل، حدد الجسيمات التي تم تحليلها وحدد قطر حجم الثقب.بعد ذلك ، من القائمة المنسدلة إظهار ، اختر خيار أقنعة التراكب ، ثم حدد خيار عرض النتائج وانقر فوق موافق. لتقسيم عدد البونتا على مساحة عائد الاستثمار الفردي، انسخ النتائج لكل صورة والصقها من النتائج المنبثقة في جدول بيانات. حدد الملف وقم بأخذ عينة من البيانات التي تم الحصول عليها منا ، وقسم مساحة عائد الاستثمار على عدد punta.وأخيرا، لتطبيع النتائج للسيطرة على العينات، متوسط النتائج لعينات التحكم وقسمة النتائج التي تم الحصول عليها من جميع العينات على متوسط الضابط. ناهض GABAB ، باكلوفين ، مطلوب لفعالية في المختبر لمضادات الاكتئاب السريعة Ro-256981. تظهر الزيادة في تكوين المشبك من خلال زيادة في بونتا البيضاء.بدون باكلوفين ، لا تظهر أي زيادة في تكوين المشبك. في الجسم الحي ، يؤدي الحقن داخل الصفاق لمضادات الاكتئاب السريعة إلى زيادة في تكوين المشبك مقارنة بالتحكم الملحي. في حين أن بعض البونتا تظهر في صور التحكم الفني ، إلا أنها ليست عموما بنفس الحجم كما هو موضح في المواصفات البيضاء مقارنة بالبونتا الكبيرة في اللوحات الأخرى.علاوة على ذلك ، فإن هذه البونتا ليست في نفس الموقع كما يتضح من بعض البونتا التي تظهر داخل السوما. يمكن ل DetectSyn تحديد التغييرات التي تطرأ على نقاط الاشتباك العصبي بسبب حالة مرضية أو علاج دوائي. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في توفير نظرة ثاقبة لأي مجال من مجالات البحث التي تدرس الاضطرابات التي تؤثر على تطور أو انهيار نقاط الاشتباك العصبي.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

والليزر السريع جس الطريقة يسهل تحديد غير الغازية وخالية الاتصال من الخواص الحرارية ورقة

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

تحليل في المختبر للكشف عن النشاط ترانسفيراز إيسوبينتينيل الحمض الريبي النووي النقال

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

منصة Seq الميثيل الفئران لتحديد تغييرات جينية المرتبطة بالتعرض للإجهاد

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

التصور الفلورسنت من الحمض النووي الريبي المانجو الموسومة في المواد الهلامية البولي أكريلاميد عن طريق طريقة بوستينينغ

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

تجزئة الخلايا لخلايا U937 عن طريق تنقية التدرج بكثافة isopycnic

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...