Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
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这项工作得到了美国国立卫生研究院NINDS R01 NS105005（KRG）和NS105005-03S1（KRG），国防部USAMRMC W81XWH-14-1-0061（KRG），NIAAA R01AA016852，NIAAA T32AA007565（CFH）以及FRAXA研究（CFH）和阿尔茨海默氏症协会AARG-NTF-21-852843（KRG），AARF-19-614794-RAPID（KRG）的资助。

从动物中分离细胞和组织符合美国国立卫生研究院的实验动物护理和使用指南，并得到维克森林机构动物护理和使用委员会的批准
注意：该协议用于已处理并根据特定实验范例和要求固定的样品。为了演示目的，由于快速抗抑郁药治疗引起的突触形成用于突出这种突触检测技术6。先前在盖玻片上培养，处理，固定在4%多聚甲醛（PFA）中并储存在1x磷酸盐缓冲...

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DetectSyn是一种快速测定，它使用接近连接测定来检测彼此相距40nm以内的蛋白质，从而可以检测突触形成。该技术改进了当前的荧光测定，其仅用作突触形成的代理测量。DetectSyn检测彼此位于40nm内（即突触间隙内）的突触蛋白的可量化变化。此外，DetectSyn更具成本效益，并且比电子显微镜和阵列断层扫描等技术花费更少的时间，这些技术旨在测量突触并经典地指定为金标准技术。 
<p class="jove_co...

突触是神经元1之间通信的基本单位。同一区域内神经元之间的许多突触会产生介导行为的回路2。突触由来自一个神经元的突触前末端组成，该神经元释放神经递质或神经肽，将信息传递给另一个神经元的突触后受体。突触前信号的总和决定了突触后神经元是否会激发动作电位并将信息传播到其他神经元。
突触病理学，突触的分解，出现在以神经体积减少为特征的疾病和病症中，如阿尔茨海默病和重度抑郁症，导致回路不再最佳执行3，4，5。恢复突触密度可能是这些疾病潜在治疗方法的有效性的基础。例如，最近证明，增加突触是快速抗抑郁药的行为功效的基础6。为了快速筛选可能的突触病理学治疗，研究人员需要快速识别突触数量变化的技术。
目前的方法既耗时又昂贵（电子显微镜检查、阵列断层扫描），或者它们仅检查突触后的变化，而不结合突触前的参与（脊柱分析、免疫荧光/共定位）。像DiI这样的染料或像GFP这样的荧光蛋白有助于可视化神经元和表征突触后棘。然而，脊柱分析使用研究人员定义的比例来确定形态，这可能会降低再现性7.此外，不同的脊柱类别如何与功能突触相关仍在被揭示8。脊柱的形成可能是短暂的，可能反映突触后可塑性，但这些棘可以在稳定成突触前神经元9的突触之前被消除。
与脊柱分析相比，共定位为突触提供了更好的代理，因为人们可以免疫染色突触前和突触后蛋白。然而，突触蛋白可能产生低共定位值，因为蛋白质是并置的，可能不会始终如一地重叠。因此，由于蛋白质不是完全叠加的，共定位技术可能无法准确测量由于这种缺失信息而导致的突触形成的变化。最后，尽管电子显微镜（EM）和阵列断层扫描都提供了突触的高分辨率图像，但它们非常耗时。EM进一步需要专门的设备，研究人员在任何给定的实验中都仅限于小体积的组织。虽然阵列断层扫描优雅地提供了在超薄切片上筛选许多蛋白质的能力，并且可以与EM10结合使用，但这种技术可能过于劳动密集型，并且超出了需要快速扫描突触形成变化的实验范围。
DetectSyn是Duolink接近连接测定的特定应用。PLA测定允许对蛋白质 - 蛋白质相互作用进行一般检测。DetectSyn通过在彼此相距40nm内的标记突触前和突触后蛋白发出的荧光信号来桥接突触后测量。如果突触蛋白在40nm以内，如在突触间隙内，则含有DNA探针的二抗将杂交成环状DNA。这种杂交的环状DNA表达荧光探针，然后用标准荧光显微镜技术将其扩增并检测（见 图1）。至关重要的是，与EM和阵列断层扫描不同，该技术不需要专门的设备，并且需要与标准免疫组织化学相同的时间。因此，该技术的可访问性使研究密集型机构以外的研究人员能够参与突触病理学研究。此外，该技术可以在单个实验中检查多个大脑区域中突触密度的变化，从而更全面地表示由于疾病或治疗引起的突触变化。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

突触是神经元之间交流的场所。神经元回路强度与突触密度有关，突触的分解是重度抑郁症（MDD）和阿尔茨海默病等疾病状态的特征。研究突触数的传统技术包括荧光标志物（例如，绿色荧光蛋白（GFP））的遗传表达，填充神经元的染料（例如，碳菁染料，DiI）和脊柱标志物的免疫荧光检测（例如，突触后密度95（PSD95））。这些代理技术的一个主要警告是，它们只能识别突触后的变化。然而，突触是突触前末梢和突触后脊柱之间的连接。测量突触形成/消除的金标准需要耗时的电子显微镜或阵列断层扫描技术。这些技术需要专门的培训和昂贵的设备。此外，只能评估有限数量的神经元，并用于表示整个大脑区域的变化。DetectSyn是一种快速荧光技术，可识别由于疾病状态或药物活性引起的突触形成或消除的变化。DetectSyn利用快速接近连接测定来检测并置的突触前和突触后蛋白质以及标准荧光显微镜，这是大多数实验室随时可用的技术。对所得点的荧光检测允许对实验进行快速和无偏倚的分析。DetectSyn提供的结果比电子显微镜更具代表性，因为可以分析比有限数量的荧光神经元更大的区域。此外，DetectSyn适用于 体外 培养的神经元和固定的组织切片。最后，提供了一种分析从该技术收集的数据的方法。总体而言，DetectSyn提供了一种检测不同治疗或疾病状态的突触密度相对变化的程序，并且比传统技术更容易获得。

本文介绍了从Heaney等人6 修改的数据，以证明一个预计突触形成增加的实验（有关更多信息和对该机制的更深入讨论，请参阅6 ）。先前，已经证明快速抗抑郁药需要激活抑制性代谢受体GABAB（γ-氨基丁酸亚型B）才能有效13。此外，先前的数据表明，快速抗抑郁药增加突触后标志物14;因此，DetectSyn被用来验证快速抗抑郁药增加?...

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DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn是一种无偏倚的快速荧光测定，可测量治疗或疾病状态下相对突触（突触前和突触后接合）数量的变化。该技术利用了一种接近连接技术，该技术既可用于培养的神经元，也可用于固定组织。

DetectSyn：一种快速、无偏倚的荧光方法，用于检测突触密度的变化

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn利用接近连接测定技术来快速识别突触的变化。我们还提供了一个协议来分析结果。DetectSyn的主要优点是在可以分析的大面积组织中获得结果的速度有多快。首先，用塑料巴斯德移液器小心地去除封闭溶液，而不会干扰细胞。然后在大型塑料培养皿上放上Parafilm。并使用镊子，小心地将盖玻片转移到Parafilm上。在盖玻片的顶部加入60微升的一抗溶液，确保抗体溶液不会溢出盖玻片的侧面。为了提供湿度并防止样品在孵育过程中变干，将超纯水添加到较小的培养皿中，并小心地将培养皿放在盖玻片周围。然后覆盖较大的培养皿，并在室温下将培养的细胞孵育一小时。与一抗一起孵育后，使用镊子小心地从盖玻片上轻拍一抗溶液，然后将其盖玻片转移到填充有500微升PBS的原始24孔板上。然后用PBS洗涤样品三次，每次10分钟，并在轨道振荡器上轻轻搅拌。最后一次洗涤后，将盖玻片移回大培养皿中，并在盖玻片的顶部加入40微升的二抗溶液。盖上培养皿，将样品在37摄氏度下孵育一小时。对于连接，在将连接酶保持在冷块上的同时，使用连接液稀释连接酶1至40，并立即将40微升连接酶混合物添加到盖玻片中。盖上培养皿，将样品在37摄氏度下孵育30分钟。对于扩增，使用扩增储液在冷块上稀释聚合酶1280。然后将40微升扩增混合物加入盖玻片中，并在37摄氏度下将样品孵育100分钟。接下来，为了进行安装，将三微升的安装介质滴到载玻片上。从盖玻片上轻敲多余的洗涤缓冲液，然后将盖玻片与细胞面朝下放入安装介质中。用少量透明指甲油密封侧面，以将盖玻片固定到位。对于切片组织的安装，小心地将纸巾片转移到准备好的载玻片上并将其平放。然后将5至10微升的安装培养基滴到组织切片上。如前所述，将玻璃盖玻片放在组织切片上，并用透明指甲油密封盖玻片。对于使用共聚焦显微镜进行数字成像，请调整每个荧光通道的增益、偏移和激光功率，以降低背景噪声并增强荧光信号。确保荧光信号不会过饱和。对于培养神经元，在“ND 采集”选项卡下，单击“保存到文件”。然后在“浏览”下，选择要保存图像的文件并输入文件名。接下来，在 Z 选项卡下，选择“由范围定义的对称模式”选项。将焦点设置为最佳双平面贴图，然后单击相对按钮将此焦平面设置为 z 堆栈的中间。接下来，将范围设置为五微米，步长为一微米，并选中Z移动时关闭活动快门。在“波长”选项卡下，在“光学配置”下，使用先前配置的采集设置选择光学按钮的名称，然后单击“立即运行”。对于切片组织，从采集菜单中选择扫描大图像，然后在捕获面板下，选择具有先前配置的采集设置的光学按钮。此外，在此面板中选择正确的物镜。接下来，在区域面板和目视点下，使用箭头键设置感兴趣区域或 ROI 的边界。然后单击“将大图像保存到文件”并为图像创建保存路径文件名。最后，在设置面板下，确保选中“多通道捕获”。然后在光学配置下选择具有先前配置的采集设置的光学按钮的名称。在 ImageJ 中，打开阈值选项，方法是转到图像菜单，单击“调整”，然后单击“阈值”。如果图像具有深色背景，请选择“深色背景”选项。接下来，根据先前确定的优化阈值设置调整阈值的上限和下限，然后单击“应用”。对于培养的细胞，使用MAP2通道和自由手ROI工具为每个神经元（包括树突和体细胞）绘制ROI。对于切片组织，在封装感兴趣区域的切片图像中绘制一个空闲的 ROI。然后，通过打开“分析”菜单并单击“度量”来获取 ROI 区域。要检测每个 ROI 中的 punta 数量，请使用自动检测工具，如粒子分析。从“已分析”菜单中，选择“分析的颗粒”并定义点滴管尺寸直径。接下来，从显示下拉菜单中选择“叠加蒙版”选项，然后选中“显示结果”选项并单击“确定”。要将平点数除以单个 ROI 的面积，请将弹出结果中每个图像的结果复制并粘贴到电子表格中。确定从哪个文件和样本中获取数据，并将 ROI 的面积除以 punta 的数量。最后，将结果归一化为对照样品，对对照样品的结果进行平均，并将所有样品的结果除以对照的平均值。GABAB激动剂巴氯芬是快速抗抑郁药Ro-256981的体外疗效所必需的。突触形成的增加通过白色蓬塔的增加来证明。没有巴氯芬，看不到突触形成的增加。在体内，腹膜内注射快速抗抑郁药导致与盐水对照相比突触形成的增加。虽然一些平底鸟出现在技术控制图像中，但与其他面板中的大平底鸟相比，它们的大小通常与白色规格所显示的尺寸不同。此外，这些punta与soma中出现的一些punta所证明的位置不同。DetectSyn可以识别由于疾病状态或药物治疗引起的突触变化。这种方法可以帮助为研究影响突触发育或分解的疾病的疾病的任何研究领域提供见解。

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