Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) og NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) og et tilskud fra FRAXA Research (CFH) og Alzheimers Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Isolering af celler og væv fra dyr var i overensstemmelse med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals og godkendt af Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
BEMÆRK: Denne protokol anvendes på prøver, der allerede er behandlet og fastgjort i henhold til specifikke eksperimentelle paradigmer og krav. Til demonstrationsformål anvendes synapsdannelse på grund af hurtig antidepressiv behandling til at fremhæve denne synapsdetektionstek...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn er et hurtigt assay, der bruger et nærhedsligeringsassay til at detektere proteiner inden for 40 nm fra hinanden, hvilket muliggør påvisning af synapsdannelse. Denne teknik forbedrer de nuværende fluorescerende assays, som kun tjener som proxymålinger til synapsdannelse. DetectSyn registrerer kvantificerbare ændringer i synaptiske proteiner lokaliseret inden for 40 nm, dvs. inden for den synaptiske kløft, af hinanden. Desuden er DetectSyn mere omkostningseffektiv og tager mindre tid end teknikker, som el...

Synapser er den grundlæggende kommunikationsenhed mellem neuroner1. Mange synapser mellem neuroner inden for de samme regioner giver anledning til kredsløb, der formidler adfærd2. Synapser består af en præsynaptisk terminal fra en neuron, der frigiver neurotransmittere eller neuropeptider, der videresender information til postsynaptiske receptorer af en anden neuron. Summen af præsynaptiske signaler bestemmer, om den postsynaptiske neuron vil affyre et handlingspotentiale og udbrede beskeden til andre neuroner.
Synaptopatologi, nedbrydning af synapser, opstår i sygdomme og lidelser præget af nedsat neuralt volumen, som Alzheimers sygdom og større depressiv lidelse, hvilket resulterer i kredsløb, der ikke længere optimalt udfører 3,4,5. Gendannelse af synapsetæthed ligger sandsynligvis til grund for effektiviteten af potentielle behandlinger for disse lidelser. For eksempel blev det for nylig påvist, at stigende synapser ligger til grund for adfærdsmæssig effektivitet af hurtige antidepressiva6. For hurtigt at screene mulige synaptopatologiske behandlinger kræver forskere teknikker, der hurtigt identificerer ændringer i synapsenumre.
Nuværende metoder er enten tidskrævende og dyre (elektronmikroskopi, arraytomografi), eller de undersøger kun postsynaptiske ændringer uden at inkorporere præsynaptisk engagement (rygsøjleanalyser, immunofluorescens / colokalisering). Farvestoffer som DiI eller fluorescerende proteiner som GFP hjælper med at visualisere neuroner og karakterisere postsynaptiske rygsøjler. Rygsøjleanalyse bruger imidlertid forskerdefinerede forhold til at bestemme morfologi, hvilket kan reducere reproducerbarheden7. Desuden er det stadig afdækket, hvordan de forskellige rygsøjleklasser relaterer sig til funktionelle synapser8. Rygsøjledannelse kan være forbigående og kan afspejle postsynaptisk plasticitet, men disse rygsøjler kan elimineres, før de stabiliseres til en synaps med en præsynaptisk neuron9.
Colokalisering giver en bedre proxy for synapser end rygsøjleanalyse, fordi man kan immunstain for præsynaptiske og postsynaptiske proteiner. Imidlertid kan synaptiske proteiner give lave colokaliseringsværdier, fordi proteinerne er sidestillet og muligvis ikke konsekvent overlapper hinanden. Fordi proteinerne ikke er helt overlejret, kan colokaliseringsteknikker muligvis ikke nøjagtigt måle ændringer i synapsdannelse på grund af denne manglende information. Endelig, selvom både elektronmikroskopi (EM) og arraytomografi giver billeder i høj opløsning af synapser, er de tidskrævende. EM kræver desuden specialudstyr, og forskere er begrænset til små mængder væv til et givet eksperiment. Mens arraytomografi elegant giver mulighed for at screene for mange proteiner på ultratynde sektioner og kan kombineres med EM10, kan denne teknik være for arbejdskrævende og uden for rammerne af eksperimenter, der skal scanne hurtigt for ændringer i synapsdannelse.
DetectSyn er en specifik anvendelse af Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen muliggør generel påvisning af protein-protein-interaktioner. DetectSyn broer proxy postsynaptiske målinger ved at forstærke et fluorescerende signal udsendt af mærkede præ- og postsynaptiske proteiner inden for 40 nm fra hinanden. Hvis de synaptiske proteiner er inden for 40 nm, som inden for en synaptisk kløft, vil de sekundære antistoffer, der indeholder DNA-sonder, hybridisere sig til cirkulært DNA. Dette hybridiserede cirkulære DNA udtrykker en fluorescerende sonde, som derefter amplificeres og detekteres med standard fluorescerende mikroskopiteknikker (se figur 1). Det afgørende er, at i modsætning til EM og array tomografi kræver denne teknik ikke specialudstyr og tager omtrent samme tid som standard immunhistokemi. Tilgængeligheden af denne teknik gør det således muligt for forskere uden for forskningsintensive institutioner at deltage i synaptopatologisk forskning. Desuden kan denne teknik undersøge ændringer i synaptisk tæthed i flere hjerneområder inden for et enkelt eksperiment, hvilket giver en mere holistisk repræsentation af synaptiske ændringer på grund af sygdom eller behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapser er stedet for kommunikation mellem neuroner. Neuronal kredsløbsstyrke er relateret til synaptisk tæthed, og nedbrydningen af synapser er karakteristisk for sygdomstilstande som større depressiv lidelse (MDD) og Alzheimers sygdom. Traditionelle teknikker til at undersøge synapsetal omfatter genetisk ekspression af fluorescerende markører (f.eks. Grønt fluorescerende protein (GFP)), farvestoffer, der fylder en neuron (f.eks. Carbocyaninfarvestof, DiI) og immunofluorescerende påvisning af rygsøjlemarkører (f.eks. Postsynaptisk densitet 95 (PSD95)). En stor advarsel mod disse proxyteknikker er, at de kun identificerer postsynaptiske ændringer. Alligevel er en synaps en forbindelse mellem en præsynaptisk terminal og en postsynaptisk rygsøjle. Guldstandarden til måling af synapsdannelse / eliminering kræver tidskrævende elektronmikroskopi eller arraytomografiteknikker. Disse teknikker kræver specialuddannelse og dyrt udstyr. Desuden kan kun et begrænset antal neuroner vurderes og bruges til at repræsentere ændringer i en hel hjerneregion. DetectSyn er en hurtig fluorescerende teknik, der identificerer ændringer i synapsdannelse eller eliminering på grund af en sygdomstilstand eller lægemiddelaktivitet. DetectSyn anvender et hurtigt nærhedsligeringsassay til at detektere sidestillede præ- og postsynaptiske proteiner og standard fluorescerende mikroskopi, en teknik, der er let tilgængelig for de fleste laboratorier. Fluorescerende detektion af den resulterende puncta muliggør hurtig og upartisk analyse af eksperimenter. DetectSyn giver mere repræsentative resultater end elektronmikroskopi, fordi større områder kan analyseres end et begrænset antal fluorescerende neuroner. Desuden fungerer DetectSyn for in vitro-dyrkede neuroner og faste vævsskiver. Endelig tilvejebringes en metode til at analysere de data, der indsamles fra denne teknik. Samlet set tilbyder DetectSyn en procedure til påvisning af relative ændringer i synapsetæthed på tværs af behandlinger eller sygdomstilstande og er mere tilgængelig end traditionelle teknikker.

Data modificeret fra Heaney et al.6 præsenteres for at demonstrere et eksperiment, hvor øget synapsdannelse forventes (se6 for mere information og en mere dybtgående diskussion af mekanismen). Tidligere blev det påvist, at hurtige antidepressiva kræver aktivering af den hæmmende metabotrope receptor, GABAB (gamma-aminosmørsyre subtype B), for at være effektiv13. Endvidere viste tidligere data, at hurtige antidepressiva øger postsynaptiske ma...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn er et upartisk, hurtigt fluorescerende assay, der måler ændringer i relativ synaps (præ- og postsynaptisk engagement) antal på tværs af behandlinger eller sygdomstilstande. Denne teknik anvender en nærhedsligeringsteknik, der kan bruges både i dyrkede neuroner og fast væv.

DetectSyn: En hurtig, upartisk fluorescerende metode til at detektere ændringer i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn udnytter nærhedsligationsanalyseteknologien til hurtigt at identificere ændringer i synapser. Vi leverer også en protokol til analyse af resultaterne. Den største fordel ved DetectSyn er, hvor hurtigt resultaterne kan opnås i de store områder af væv, der kan analyseres.Til at begynde med skal du forsigtigt fjerne blokeringsopløsningen med en plastpastepipette uden at forstyrre cellerne. Link derefter en stor plastik petriskål med Parafilm. Og brug tang til forsigtigt at overføre dæksedlen til Parafilmen.Tilsæt 60 mikroliter af den primære antistofopløsning til toppen af dækslet, så det sikres, at antistofopløsningen ikke spildes ud over siderne af dækslet. For at give fugtighed og forhindre prøver i at tørre ud under inkubation, tilsæt ultrarent vand til en mindre petriskål, og læg forsigtigt skålen omkring dækslipsene. Dæk derefter den større petriskål og inkuber de dyrkede celler i en time ved stuetemperatur.Efter inkubation med det primære antistof skal du bruge tang til forsigtigt at tappe den primære antistofopløsning fra dæksedlen på et papirhåndklæde og overføre dæksedlen til deres originale 24-brønds plade fyldt med 500 mikroliter PBS. Derefter vaskes prøverne med PBS tre gange i 10 minutter hver med blid omrøring på en orbital ryster. Efter den sidste vask overføres dækslet tilbage til den store petriskål og tilsættes 40 mikroliter af den sekundære antistofopløsning til toppen af dækslet.Dæk petriskålen og inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i en time. Til ligering, mens ligasen holdes på en kold blok, fortyndes ligasen 1 til 40 ved hjælp af ligationsbestanden og tilsættes straks 40 mikroliter ligaseblandingen til dæksglitterne. Dæk petriskålen til og inkuber prøverne ved 37 grader Celsius i 30 minutter.Til forstærkning fortyndes polymerasen 1280 på en kold blok ved anvendelse af forstærkningsbestanden. Derefter tilsættes 40 mikroliter af forstærkningsblandingen til dækslipsene og inkuberes prøverne i 100 minutter ved 37 grader Celsius. Slip derefter tre mikroliter monteringsmedier på et dias til montering.Tryk overskydende vaskebuffer af fra dækslet, og anbring dækslet med celler, der vender nedad i monteringsmediet. Forsegl siderne med en lille mængde klar neglelak for at holde dækslet på plads. Til montering af skiveskåret væv skal du forsigtigt overføre en vævsskive til det forberedte dias og lægge det fladt.Slip derefter 5 til 10 mikroliter monteringsmedier på vævsskiven. Læg et glasdæksel glide over vævsskiven og forsegl dækslet med klar neglelak, som vist tidligere. Til digital billeddannelse med et konfokalmikroskop skal du justere forstærknings-, forskydnings- og lasereffekten for hver fluorescerende kanal for at reducere baggrundsstøj og forbedre det fluorescerende signal.Sørg for, at det fluorescerende signal ikke er overmættet. For kulturneuronerne skal du klikke på Gem i fil under fanen ND-erhvervelse. Vælg derefter en fil under Gennemse for at gemme billedet og indtaste filnavnet.Vælg derefter indstillingen Symmetrisk tilstand defineret af rækkevidde under fanen Z. Indstil fokus til det bedste kort to-plan, og klik på knappen Relativ for at indstille dette fokusplan som midten af z-stakken. Indstil derefter området til fem mikrometer med et mikrometertrin, og kontroller Luk aktiv lukker under Z-bevægelse.Under fanen Bølgelængde skal du vælge navnet på den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under Optisk konfiguration og klikke på Kør nu. For skiveskåret væv skal du i menuen Anskaffelse vælge Scan stort billede og derefter vælge den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under optagelsespanelet. Vælg også det rigtige mål i dette panel.Brug derefter piletasterne under områdepanelet og øjestykket til at indstille grænserne for interesseområdet eller ROI. Klik derefter på Gem stort billede til fil, og opret et filtypenavn til billedet. Endelig skal du under opsætningspanelet sikre dig, at Multichannel Capture er markeret.Vælg derefter navnet på den optiske knap med de tidligere konfigurerede anskaffelsesindstillinger under optisk konfiguration. I ImageJ skal du åbne tærskelindstillingen ved at gå til billedmenuen, klikke på Juster og derefter Tærskelværdi. Vælg Mørk baggrund mulighed, hvis billedet har en mørk baggrund.Juster derefter de øvre og nedre grænser for tærsklen pr. Tidligere bestemte optimerede tærskelindstillinger, og klik på Anvend. For dyrkede celler skal du bruge MAP2-kanalen og et ROI-værktøj med fri hånd til at tegne et ROI for hver neuron, herunder dendritter og soma. For skiveskåret væv skal du tegne en ROI med fri hånd i skivebilledet, der indkapsler interesseområdet.Få derefter området for ROI ved at åbne menuen Analyser og klikke på Mål. For at registrere antallet af punta inden for hver ROI skal du bruge et automatisk detektionsværktøj som partikelanalyse. Vælg Analyserede partikler i menuen Analyseret, og definer punktstørrelsesdiameteren.Vælg derefter indstillingen Overlaymasker i rullemenuen Vis, kontroller derefter indstillingen Vis resultater, og klik på Okay. For at opdele antallet af punta med området for det enkelte investeringsafkast skal du kopiere og indsætte resultaterne for hvert billede fra resultaterne, der dukker op i et regneark. Identificer, hvilken fil og prøve de data, vi er hentet fra, og divider området for ROI med antallet af punta.Endelig, for at normalisere resultaterne til kontrolprøver, gennemsnit resultaterne for kontrolprøverne og divider de opnåede resultater af alle prøver med gennemsnittet af kontrollen. GABAB-agonisten, baclofen, er nødvendig for in vitro-effekten af det hurtige antidepressive middel Ro-256981. En stigning i synapsdannelsen demonstreres ved en stigning i hvid punta.Uden baclofen ses ingen stigning i synapsdannelsen. In vivo resulterer intraperitoneal injektion af det hurtige antidepressive middel i en stigning i synapsdannelsen sammenlignet med saltvandskontrollen. Mens nogle punta vises i de tekniske kontrolbilleder, er de generelt ikke den samme størrelse som demonstreret af den hvide spec sammenlignet med den store punta i de andre paneler.Desuden er disse punta ikke på samme sted som demonstreret af nogle punta, der vises inden for soma. DetectSyn kan identificere ændringer i synapser på grund af en sygdomstilstand eller lægemiddelbehandling. Denne metode kan hjælpe med at give indsigt i ethvert forskningsområde, der studerer de lidelser, der påvirker udviklingen eller nedbrydningen af synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En hurtig Laser Sondering Metode Letter ikke-invasive og Kontakt-fri Bestemmelse af Leaf Termiske egenskaber

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplex isotermisk forstærkning baseret diagnostiske Platform til at opdage Zika, Chikungunya og Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay at opdage tRNA-Isopentenyl-Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En rotte Methyl-Seq Platform til at identificere epigenetiske ændringer forbundet med Stress eksponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerende visualisering af mango-Tagged RNA i polyacrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraktionering af U937-celler ved isopycnic densitetsgradientrensning

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...