Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door national institutes of health NINDS R01 NS105005 (KRG) en NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), en een subsidie van FRAXA Research (CFH) en de Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Isolatie van cellen en weefsel van dieren was in overeenstemming met de Gids voor de Verzorging en het Gebruik van Proefdieren van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
OPMERKING: Dit protocol wordt gebruikt op monsters die al zijn behandeld en vastgelegd volgens specifieke experimentele paradigma's en vereisten. Voor demonstratiedoeleinden wordt synapsvorming als gevolg van snelle antidepressieve behandeling gebruikt om...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn is een snelle test die een nabijheidsligatietest gebruikt om eiwitten binnen 40 nm van elkaar te detecteren, wat de detectie van synapsvorming mogelijk maakt. Deze techniek verbetert de huidige fluorescerende assays, die alleen dienen als proxy-metingen voor synapsvorming. DetectSyn detecteert kwantificeerbare veranderingen in synaptische eiwitten gelokaliseerd binnen 40 nm, d.w.z. binnen de synaptische spleet, van elkaar. Verder is DetectSyn kosteneffectiever en kost het minder tijd dan technieken, zoals elekt...

Synapsen zijn de fundamentele eenheid van communicatie tussen neuronen1. Veel synapsen tussen neuronen binnen dezelfde regio's geven aanleiding tot circuits die gedrag bemiddelen2. Synapsen bestaan uit een presynaptische terminal van een neuron die neurotransmitters of neuropeptiden vrijgeeft die informatie doorgeven aan postsynaptische receptoren van een ander neuron. De som van presynaptische signalen bepaalt of het postsynaptische neuron een actiepotentiaal zal afvuren en de boodschap naar andere neuronen zal verspreiden.
Synaptopathologie, het afbreken van synapsen, ontstaat bij ziekten en aandoeningen die gekenmerkt worden door een verminderd neuraal volume, zoals de ziekte van Alzheimer en depressieve stoornis, waardoor circuits die niet meer optimaal presteren 3,4,5. Het herstellen van de synapsdichtheid ligt waarschijnlijk ten grondslag aan de werkzaamheid van mogelijke behandelingen voor deze aandoeningen. Onlangs werd bijvoorbeeld aangetoond dat toenemende synapsen ten grondslag liggen aan de gedragsmatige werkzaamheid van snelle antidepressiva6. Om mogelijke synaptopathologische behandelingen snel te screenen, hebben onderzoekers technieken nodig die snel veranderingen in synapsnummers identificeren.
De huidige methodologieën zijn ofwel tijdrovend en duur (elektronenmicroscopie, arraytomografie), of ze onderzoeken alleen postsynaptische veranderingen zonder presynaptische betrokkenheid op te nemen (wervelkolomanalyses, immunofluorescentie / colocalisatie). Kleurstoffen zoals DiI of fluorescerende eiwitten zoals GFP helpen neuronen te visualiseren en postsynaptische stekels te karakteriseren. Wervelkolomanalyse maakt echter gebruik van door onderzoekers gedefinieerde verhoudingen om morfologie te bepalen, wat de reproduceerbaarheid kan verminderen7. Verder wordt nog steeds blootgelegd hoe de verschillende wervelkolomklassen zich verhouden tot functionele synapsen8. Wervelkolomvorming kan van voorbijgaande aard zijn en kan postsynaptische plasticiteit weerspiegelen, maar deze stekels kunnen worden geëlimineerd voordat ze stabiliseren in een synaps met een presynaptisch neuron9.
Colocalisatie biedt een betere proxy voor synapsen dan wervelkolomanalyse omdat men presynaptische en postsynaptische eiwitten kan immunostainen. Synaptische eiwitten kunnen echter lage colocalisatiewaarden opleveren omdat de eiwitten naast elkaar staan en mogelijk niet consistent overlappen. Dus, omdat de eiwitten niet volledig over elkaar heen liggen, kunnen colocalisatietechnieken veranderingen in synapsvorming niet nauwkeurig meten als gevolg van deze ontbrekende informatie. Ten slotte, hoewel zowel elektronenmicroscopie (EM) als arraytomografie beelden met hoge resolutie van synapsen bieden, zijn ze tijdrovend. EM vereist verder gespecialiseerde apparatuur en onderzoekers zijn beperkt tot kleine hoeveelheden weefsel voor een bepaald experiment. Hoewel arraytomografie elegant de mogelijkheid biedt om te screenen op veel eiwitten op ultradunne secties en kan worden gecombineerd met EM10, kan deze techniek te arbeidsintensief zijn en buiten het bereik van experimenten vallen die snel moeten scannen op veranderingen in synapsvorming.
DetectSyn is een specifieke toepassing van de Duolink Proximity Ligation Assay. De PLA-test maakt de algemene detectie van eiwit-eiwitinteracties mogelijk. DetectSyn overbrugt proxy postsynaptische metingen door een fluorescerend signaal te versterken dat wordt uitgezonden door gelabelde pre- en postsynaptische eiwitten binnen 40 nm van elkaar. Als de synaptische eiwitten zich binnen 40 nm bevinden, zoals in een synaptische spleet, dan zullen de secundaire antilichamen, die DNA-sondes bevatten, hybridiseren tot circulair DNA. Dit gehybridiseerde cirkelvormige DNA drukt een fluorescerende sonde uit, die vervolgens wordt versterkt en gedetecteerd met standaard fluorescerende microscopietechnieken (zie figuur 1). Cruciaal is dat deze techniek, in tegenstelling tot EM- en arraytomografie, geen gespecialiseerde apparatuur vereist en ongeveer evenveel tijd in beslag neemt als standaard immunohistochemie. De toegankelijkheid van deze techniek stelt onderzoekers buiten onderzoeksintensieve instellingen dus in staat om deel te nemen aan synaptopathologisch onderzoek. Verder kan deze techniek veranderingen in synaptische dichtheid in meerdere hersengebieden binnen één experiment onderzoeken, waardoor een meer holistische weergave van synaptische veranderingen als gevolg van ziekte of behandeling wordt geboden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapsen zijn de plaats van communicatie tussen neuronen. Neuronale circuitsterkte is gerelateerd aan synaptische dichtheid en de afbraak van synapsen is kenmerkend voor ziektetoestanden zoals depressieve stoornis (MDD) en de ziekte van Alzheimer. Traditionele technieken om synapsgetallen te onderzoeken omvatten genetische expressie van fluorescerende markers (bijv. Groen fluorescerend eiwit (GFP)), kleurstoffen die een neuron vullen (bijv. Carbocyaninekleurstof, DiI) en immunofluorescente detectie van wervelkolommarkers (bijv. Postsynaptische dichtheid 95 (PSD95)). Een belangrijk voorbehoud bij deze proxytechnieken is dat ze alleen postsynaptische veranderingen identificeren. Toch is een synaps een verbinding tussen een presynaptische terminal en een postsynaptische wervelkolom. De gouden standaard voor het meten van synapsvorming/-eliminatie vereist tijdrovende elektronenmicroscopie of arraytomografietechnieken. Deze technieken vereisen gespecialiseerde training en dure apparatuur. Verder kan slechts een beperkt aantal neuronen worden beoordeeld en worden ze gebruikt om veranderingen in een heel hersengebied weer te geven. DetectSyn is een snelle fluorescerende techniek die veranderingen in synapsvorming of -eliminatie identificeert als gevolg van een ziektetoestand of medicijnactiviteit. DetectSyn maakt gebruik van een snelle nabijheidsligatietest om naast elkaar geplaatste voor- en postsynaptische eiwitten en standaard fluorescerende microscopie te detecteren, een techniek die gemakkelijk beschikbaar is voor de meeste laboratoria. Fluorescerende detectie van de resulterende puncta maakt een snelle en onbevooroordeelde analyse van experimenten mogelijk. DetectSyn biedt meer representatieve resultaten dan elektronenmicroscopie omdat grotere gebieden kunnen worden geanalyseerd dan een beperkt aantal fluorescerende neuronen. Bovendien werkt DetectSyn voor in vitro gekweekte neuronen en vaste weefselplakken. Ten slotte wordt een methode geboden om de gegevens die uit deze techniek worden verzameld, te analyseren. Over het algemeen biedt DetectSyn een procedure voor het detecteren van relatieve veranderingen in synapsdichtheid tussen behandelingen of ziektetoestanden en is toegankelijker dan traditionele technieken.

Gegevens die zijn gewijzigd van Heaney et al.6 worden gepresenteerd om een experiment aan te tonen waarbij verhoogde synapsvorming wordt verwacht (zie6 voor meer informatie en een meer diepgaande bespreking van het mechanisme). Eerder werd aangetoond dat snelle antidepressiva activering van de remmende metabotrope receptor, GABAB (gamma-aminoboterzuur subtype B), vereisen om effectief te zijn13. Verder gaven eerdere gegevens aan dat snelle antidepres...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn is een onbevooroordeelde, snelle fluorescerende test die veranderingen meet in het relatieve synapsnummer (pre- en postsynaptische betrokkenheid) over behandelingen of ziektetoestanden. Deze techniek maakt gebruik van een nabijheidsligatietechniek die zowel in gekweekte neuronen als in vast weefsel kan worden gebruikt.

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn maakt gebruik van de proximity ligation assay-technologie om snel veranderingen in synapsen te identificeren. We bieden ook een protocol om de resultaten te analyseren. Het belangrijkste voordeel van DetectSyn is hoe snel de resultaten kunnen worden verkregen in de grote weefselgebieden die kunnen worden geanalyseerd.Verwijder om te beginnen voorzichtig de blokkerende oplossing met een plastic Pasteur-pipet zonder de cellen te verstoren. Bekleed vervolgens een grote plastic petrischaal met Parafilm. En breng met een tang de afdekslipjes voorzichtig over naar de Parafilm.Voeg 60 microliter van de primaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de afdekslip, zodat de antilichaamoplossing niet over de zijkanten van de afdekslip morst. Om vocht te bieden en te voorkomen dat monsters uitdrogen tijdens de incubatie, voegt u ultrapuur water toe aan een kleinere petrischaal en plaatst u de schaal voorzichtig rond de hoesjes. Bedek vervolgens de grotere petrischaal en incubeer de gekweekte cellen gedurende een uur bij kamertemperatuur.Gebruik na incubatie met het primaire antilichaam een tang om de primaire antilichaamoplossing voorzichtig van de afdekplaatjes op een papieren handdoek af te tikken en de afdekslipjes over te brengen naar hun oorspronkelijke 24-putplaat gevuld met 500 microliter PBS. Was de monsters vervolgens driemaal met PBS gedurende 10 minuten, elk met zachte agitatie op een orbitale shaker. Breng na de laatste wasbeurt de afdekplaat terug naar de grote petrischaal en voeg 40 microliter van de secundaire antilichaamoplossing toe aan de bovenkant van de afdekslip.Dek de petrischaal af en incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Voor ligatie, terwijl u de ligase op een koud blok houdt, verdunt u de ligase 1 tot 40 met behulp van de ligatievoorraad en voegt u onmiddellijk 40 microliter van het ligasemengsel toe aan de afdekslips. Dek de petrischaal af en incubeer de monsters bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten.Verdun voor versterking het polymerase 1280 op een koud blok met behulp van de versterkingsvoorraad. Voeg vervolgens 40 microliter van het versterkingsmengsel toe aan de afdekslips en incubeer de monsters gedurende 100 minuten bij 37 graden Celsius. Laat vervolgens voor de montage drie microliter montagemedia op een dia vallen.Tik overtollige wasbuffer van de afdekslip af en plaats de afdekslip met cellen naar beneden gericht in de montagemedia. Sluit de zijkanten af met een kleine hoeveelheid doorzichtige nagellak om de hoesslip op zijn plaats te houden. Voor het monteren van gesneden weefsel, breng voorzichtig een weefselschijf over op de voorbereide dia en leg deze plat.Laat vervolgens 5 tot 10 microliter montagemedia op de plak van het weefsel vallen. Plaats een glasslepper over de plak tissues en sluit de afdekslip af met heldere nagellak, zoals eerder aangetoond. Voor digitale beeldvorming met een confocale microscoop past u de versterking, offset en laservermogen voor elk fluorescerend kanaal aan om achtergrondruis te verminderen en het fluorescerende signaal te verbeteren.Zorg ervoor dat het fluorescerende signaal niet oververzadigd is. Voor de kweekneuronen, klik onder het tabblad ND-acquisitie op Opslaan in bestand. Kies vervolgens onder Bladeren een bestand om de afbeelding op te slaan en voer de bestandsnaam in.Selecteer vervolgens op het tabblad Z de optie Symmetrische modus gedefinieerd door bereik. Stel de focus in op de beste kaart met twee vlakken en klik op de knop Relatief om dit brandpuntsvlak in te stellen als het midden van de z-stack. Stel vervolgens het bereik in op vijf micrometer met stappen van één micrometer en controleer Actieve sluiter sluiten tijdens Z-beweging.Selecteer op het tabblad Golflengte de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder Optische configuratie en klik op Nu uitvoeren. Voor gesneden weefsel kiest u in het acquire-menu Grote afbeelding scannen en selecteert u vervolgens onder het opnamepaneel de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen. Selecteer ook de juiste doelstelling in dit deelvenster.Gebruik vervolgens onder het gebiedspaneel en het oogstuk de pijltoetsen om de grenzen van het interessegebied of de ROI in te stellen. Klik vervolgens op Grote afbeelding opslaan in bestand en maak een bestandsnaam voor het opslaan van het pad voor de afbeelding. Zorg er ten slotte onder het installatiepaneel voor dat Multichannel Capture is gecontroleerd.Kies vervolgens de naam van de optische knop met de eerder geconfigureerde acquisitie-instellingen onder optische configuratie. Open in ImageJ de drempeloptie door naar het afbeeldingsmenu te gaan, op Aanpassen en vervolgens op Drempel te klikken. Kies de optie Donkere achtergrond als de afbeelding een donkere achtergrond heeft.Pas vervolgens de boven- en ondergrenzen van de drempel aan per vooraf bepaalde geoptimaliseerde drempelinstellingen en klik op Toepassen. Gebruik voor gekweekte cellen het MAP2-kanaal en een ROI-tool uit de vrije hand om een ROI te tekenen voor elk neuron, inclusief dendrieten en soma. Voor gesneden weefsel tekent u een ROI uit de vrije hand in de segmentafbeelding die het interessegebied inkapselt.Verkrijg vervolgens het gebied van de ROI door het menu Analyseren te openen en op Meten te klikken. Om het aantal punta binnen elke ROI te detecteren, gebruikt u een automatische detectietool zoals deeltjesanalyse. Selecteer in het menu Geanalyseerd de optie Geanalyseerde deeltjes en definieer de puncta-diameter.Kies vervolgens in het vervolgkeuzemenu show de optie Overlaymaskers, vink vervolgens de optie Resultaten weergeven aan en klik op OK. Om het aantal punta te delen door het gebied van de individuele ROI, kopieert en plakt u de resultaten voor elke afbeelding uit de resultaten die in een spreadsheet verschijnen. Identificeer uit welk bestand en monster de gegevens waaruit we zijn verkregen en deel het gebied van de ROI door het aantal punta.Ten slotte, om de resultaten voor controlemonsters te normaliseren, de resultaten voor de controlemonsters gemiddeld en de verkregen resultaten van alle monsters te delen door het gemiddelde van de controle. De GABAB-agonist, baclofen, is vereist voor de in vitro werkzaamheid van het snelle antidepressivum Ro-256981. Een toename van synapsvorming wordt aangetoond door een toename van witte punta.Zonder baclofen wordt geen toename van synapsvorming gezien. In vivo resulteert intraperitoneale injectie van het snelle antidepressivum in een toename van de synapsvorming in vergelijking met de zoutoplossingcontrole. Hoewel sommige punta's in de technische controlebeelden voorkomen, zijn ze over het algemeen niet even groot als de witte specificatie in vergelijking met de grote punta in de andere panelen.Verder bevinden deze punta's zich niet op dezelfde locatie als aangetoond door sommige punta's die in de soma voorkomen. DetectSyn kan veranderingen in synapsen identificeren als gevolg van een ziektetoestand of medicamenteuze behandeling. Deze methode kan helpen inzicht te geven in elk onderzoeksgebied dat de aandoeningen bestudeert die de ontwikkeling of afbraak van synapsen beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

Een Rapid Laser Probing Methode faciliteert de niet-invasieve en Contacteer-vrij Bepaling van Leaf thermische eigenschappen

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

Een Rat Methyl-Seq Platform om epigenetische veranderingen Associated with Stress Exposure te identificeren

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...