Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) und NS105005-03S1 (KRG), dem Verteidigungsministerium USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) und einem Zuschuss von FRAXA Research (CFH) und der Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG), unterstützt.

Die Isolierung von Zellen und Gewebe von Tieren erfolgte in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurde vom Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt.
HINWEIS: Dieses Protokoll wird für Proben verwendet, die bereits gemäß bestimmten experimentellen Paradigmen und Anforderungen behandelt und fixiert wurden. Zu Demonstrationszwecken wird die Synapsenbildung durch eine schnelle antidepress...

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. 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(65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn ist ein Schnellassay, der einen Proximity-Ligationsassay verwendet, um Proteine innerhalb von 40 nm voneinander nachzuweisen, was den Nachweis der Synapsenbildung ermöglicht. Diese Technik verbessert aktuelle fluoreszierende Assays, die nur als Proxy-Messungen für die Synapsenbildung dienen. DetectSyn erkennt quantifizierbare Veränderungen in synaptischen Proteinen, die innerhalb von 40 nm, d.h. innerhalb des synaptischen Spalts, voneinander lokalisiert sind. Darüber hinaus ist DetectSyn kostengünstiger un...

Synapsen sind die grundlegende Einheit der Kommunikation zwischen Neuronen1. Viele Synapsen zwischen Neuronen innerhalb derselben Regionen führen zu Schaltkreisen, die das Verhalten vermitteln2. Synapsen bestehen aus einem präsynaptischen Terminal von einem Neuron, das Neurotransmitter oder Neuropeptide freisetzt, die Informationen an postsynaptische Rezeptoren eines anderen Neurons weiterleiten. Die Summe präsynaptischer Signale bestimmt, ob das postsynaptische Neuron ein Aktionspotential auslöst und die Nachricht an andere Neuronen weitergibt.
Synaptopathologie, der Abbau von Synapsen, entsteht bei Krankheiten und Störungen, die durch ein vermindertes neuronales Volumen gekennzeichnet sind, wie Alzheimer-Krankheit und schwere depressive Störung, was zu Schaltkreisen führt, die nicht mehr optimal funktionieren 3,4,5. Die Wiederherstellung der Synapsendichte liegt wahrscheinlich der Wirksamkeit potenzieller Behandlungen für diese Erkrankungen zugrunde. Zum Beispiel wurde kürzlich gezeigt, dass zunehmende Synapsen der Verhaltenswirksamkeit von schnellen Antidepressivazugrunde liegen 6. Um mögliche synaptopathologische Behandlungen schnell zu screenen, benötigen Forscher Techniken, die Veränderungen der Synapsenzahlen schnell identifizieren.
Aktuelle Methoden sind entweder zeitaufwendig und teuer (Elektronenmikroskopie, Array-Tomographie) oder sie untersuchen nur postsynaptische Veränderungen, ohne präsynaptische Interaktion (Wirbelsäulenanalysen, Immunfluoreszenz/-kolokalisation) einzubeziehen. Farbstoffe wie DiI oder fluoreszierende Proteine wie GFP helfen, Neuronen sichtbar zu machen und postsynaptische Stacheln zu charakterisieren. Die Wirbelsäulenanalyse verwendet jedoch von Forschern definierte Verhältnisse, um die Morphologie zu bestimmen, was die Reproduzierbarkeit verringernkann 7. Darüber hinaus wird immer noch aufgedeckt, wie sich die verschiedenen Wirbelsäulenklassen auf funktionelle Synapsen beziehen8. Die Wirbelsäulenbildung kann vorübergehend sein und die postsynaptische Plastizität widerspiegeln, aber diese Stacheln könnten eliminiert werden, bevor sie sich mit einem präsynaptischen Neuron9 zu einer Synapse stabilisieren.
Die Kolokalisation bietet einen besseren Proxy für Synapsen als die Wirbelsäulenanalyse, da man eine Immunstrukturierung für präsynaptische und postsynaptische Proteine durchführen kann. Synaptische Proteine können jedoch niedrige Kolokalisationswerte ergeben, da die Proteine nebeneinander stehen und sich möglicherweise nicht konsistent überlappen. Da die Proteine nicht vollständig überlagert sind, können Kolokalisierungstechniken aufgrund dieser fehlenden Informationen Änderungen der Synapsenbildung möglicherweise nicht genau messen. Obwohl sowohl die Elektronenmikroskopie (EM) als auch die Array-Tomographie hochauflösende Bilder von Synapsen liefern, sind sie zeitaufwendig. EM erfordert außerdem spezielle Ausrüstung, und die Forscher sind auf kleine Gewebevolumina für ein bestimmtes Experiment beschränkt. Während die Array-Tomographie elegant die Möglichkeit bietet, auf ultradünne Abschnitte nach vielen Proteinen zu suchen und mit EM10 kombiniert werden kann, kann diese Technik zu arbeitsintensiv sein und den Rahmen von Experimenten sprengen, die schnell nach Veränderungen der Synapsenbildung suchen müssen.
DetectSyn ist eine spezifische Anwendung des Duolink Proximity Ligation Assay. Der PLA-Assay ermöglicht den allgemeinen Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen. DetectSyn überbrückt postsynaptische Proxy-Messungen, indem es ein fluoreszierendes Signal verstärkt, das von markierten prä- und postsynaptischen Proteinen innerhalb von 40 nm voneinander emittiert wird. Wenn sich die synaptischen Proteine innerhalb von 40 nm befinden, wie in einem synaptischen Spalt, dann hybridisieren die sekundären Antikörper, die DNA-Sonden enthalten, zu zirkulärer DNA. Diese hybridisierte zirkuläre DNA exprimiert eine fluoreszierende Sonde, die dann mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie-Techniken amplifiziert und nachgewiesen wird (siehe Abbildung 1). Entscheidend ist, dass diese Technik im Gegensatz zu EM und Array-Tomographie keine spezielle Ausrüstung erfordert und etwa die gleiche Zeit in Anspruch nimmt wie die Standard-Immunhistochemie. Die Zugänglichkeit dieser Technik ermöglicht es somit Forschern außerhalb forschungsintensiver Institutionen, an der synaptopathologischen Forschung teilzunehmen. Darüber hinaus kann diese Technik Veränderungen der synaptischen Dichte in mehreren Gehirnregionen innerhalb eines einzigen Experiments untersuchen und bietet eine ganzheitlichere Darstellung synaptischer Veränderungen aufgrund von Krankheit oder Behandlung.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapsen sind der Ort der Kommunikation zwischen Neuronen. Die Stärke des neuronalen Schaltkreises hängt mit der synaptischen Dichte zusammen, und der Abbau von Synapsen ist charakteristisch für Krankheitszustände wie schwere depressive Störungen (MDD) und Alzheimer-Krankheit. Traditionelle Techniken zur Untersuchung der Synapsenzahlen umfassen die genetische Expression von fluoreszierenden Markern (z. B. grün fluoreszierendes Protein (GFP)), Farbstoffe, die ein Neuron füllen (z. B. Carbocyaninfarbstoff, DiI), und der immunfluoreszierende Nachweis von Wirbelsäulenmarkern (z. B. postsynaptische Dichte 95 (PSD95)). Ein wichtiger Vorbehalt gegenüber diesen Proxy-Techniken ist, dass sie nur postsynaptische Veränderungen identifizieren. Eine Synapse ist jedoch eine Verbindung zwischen einem präsynaptischen Terminal und einer postsynaptischen Wirbelsäule. Der Goldstandard zur Messung der Synapsenbildung/-elimination erfordert zeitaufwändige Elektronenmikroskopie- oder Array-Tomographie-Techniken. Diese Techniken erfordern spezielle Schulungen und teure Ausrüstung. Darüber hinaus kann nur eine begrenzte Anzahl von Neuronen beurteilt werden und wird verwendet, um Veränderungen in einer ganzen Gehirnregion darzustellen. DetectSyn ist eine schnelle fluoreszierende Technik, die Veränderungen der Synapsenbildung oder -eliminierung aufgrund eines Krankheitszustands oder einer Arzneimittelaktivität identifiziert. DetectSyn verwendet einen schnellen Proximity-Ligationsassay, um nebeneinander liegende prä- und postsynaptische Proteine und die Standard-Fluoreszenzmikroskopie nachzuweisen, eine Technik, die den meisten Labors leicht zur Verfügung steht. Die fluoreszierende Detektion der resultierenden Puncta ermöglicht eine schnelle und unvoreingenommene Analyse von Experimenten. DetectSyn liefert repräsentativere Ergebnisse als die Elektronenmikroskopie, da größere Bereiche analysiert werden können als eine begrenzte Anzahl fluoreszierender Neuronen. Darüber hinaus funktioniert DetectSyn für in vitro kultivierte Neuronen und festsitzende Gewebeschnitte. Schließlich wird eine Methode bereitgestellt, um die von dieser Technik gesammelten Daten zu analysieren. Insgesamt bietet DetectSyn ein Verfahren zur Erkennung relativer Veränderungen der Synapsendichte über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg und ist zugänglicher als herkömmliche Techniken.

Daten, die von Heaney et al.6 modifiziert wurden, werden vorgestellt, um ein Experiment zu demonstrieren, bei dem eine erhöhte Synapsenbildung erwartet wird (siehe6 für weitere Informationen und eine eingehendere Diskussion des Mechanismus). Zuvor konnte gezeigt werden, dass schnelle Antidepressiva die Aktivierung des inhibitorischen metabotropen Rezeptors GABAB (Gamma-Aminobuttersäure-Subtyp B) erfordern, um wirksam zu sein13. Darüber hinaus deu...

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DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn ist ein unvoreingenommener, schneller fluoreszierender Assay, der Veränderungen der relativen Synapsenzahl (prä- und postsynaptisches Engagement) über Behandlungen oder Krankheitszustände hinweg misst. Diese Technik verwendet eine Proximity-Ligationstechnik, die sowohl in kultivierten Neuronen als auch in festem Gewebe eingesetzt werden kann.

DetectSyn: Eine schnelle, unvoreingenommene fluoreszierende Methode zur Erkennung von Änderungen der Synapsendichte

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn nutzt die Proximity-Ligations-Assay-Technologie, um Veränderungen an Synapsen schnell zu identifizieren. Wir stellen auch ein Protokoll zur Verfügung, um die Ergebnisse zu analysieren. Der Hauptvorteil von DetectSyn besteht darin, wie schnell die Ergebnisse in den großen Geweberegionen erzielt werden können, die analysiert werden können.Entfernen Sie zunächst vorsichtig die blockierende Lösung mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff, ohne die Zellen zu stören. Dann eine große Plastik-Petrischale mit Parafilm auslegen. Und mit einer Pinzette die Deckscheine vorsichtig auf den Parafilm übertragen.Fügen Sie 60 Mikroliter der primären Antikörperlösung auf die Oberseite des Deckglases hinzu, um sicherzustellen, dass die Antikörperlösung nicht über die Seiten des Deckglases verschüttet. Um Feuchtigkeit zu spenden und zu verhindern, dass Proben während der Inkubation austrocknen, fügen Sie einer kleineren Petrischale Reinstwasser hinzu und legen Sie die Schale vorsichtig um die Deckblätter. Dann die größere Petrischale abdecken und die kultivierten Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubieren.Nach der Inkubation mit dem primären Antikörper verwenden Sie eine Pinzette, um die primäre Antikörperlösung vorsichtig von den Deckgläsern auf ein Papiertuch abzuklopfen und die Deckzettel auf ihre ursprüngliche 24-Well-Platte zu übertragen, die mit 500 Mikrolitern PBS gefüllt ist. Dann waschen Sie die Proben dreimal mit PBS für jeweils 10 Minuten mit sanftem Rühren auf einem Orbitalschüttler. Nach dem letzten Waschen die Deckblätter zurück in die große Petrischale geben und 40 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung auf die Oberseite des Deckglases geben.Decken Sie die Petrischale ab und inkubieren Sie die Proben bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Für die Ligatur, während Sie die Ligase auf einem kalten Block halten, verdünnen Sie die Ligase 1 bis 40 mit dem Ligationsmaterial und fügen Sie sofort 40 Mikroliter der Ligasemischung zu den Deckgläsern hinzu. Die Petrischale abdecken und die Proben bei 37 Grad Celsius 30 Minuten lang inkubieren.Zur Amplifikation verdünnen Sie die Polymerase 1280 auf einem kalten Block mit dem Verstärkungsmaterial. Geben Sie dann 40 Mikroliter der Verstärkungsmischung zu den Deckgläsern und inkubieren Sie die Proben für 100 Minuten bei 37 Grad Celsius. Als nächstes lassen Sie für die Montage drei Mikroliter Montagemedien auf einen Objektträger fallen.Klopfen Sie überschüssigen Waschpuffer vom Deckglas ab und legen Sie den Deckzettel mit den Zellen nach unten in das Montagemedium. Versiegeln Sie die Seiten mit einer kleinen Menge klarem Nagellack, um den Deckzettel an Ort und Stelle zu halten. Für die Montage von geschnittenem Gewebe eine Gewebescheibe vorsichtig auf den vorbereiteten Objektträger geben und flach legen.Dann lassen Sie 5 bis 10 Mikroliter Montagemedien auf die Gewebescheibe fallen. Legen Sie einen Glasdeckel über die Gewebescheibe und verschließen Sie den Decklack mit klarem Nagellack, wie bereits gezeigt. Für die digitale Bildgebung mit einem konfokalen Mikroskop passen Sie die Verstärkung, den Offset und die Laserleistung für jeden Fluoreszenzkanal an, um Hintergrundrauschen zu verringern und das Fluoreszenzsignal zu verbessern.Stellen Sie sicher, dass das fluoreszierende Signal nicht übersättigt ist. Klicken Sie für die Kulturneuronen auf der Registerkarte ND-Akquisition auf In Datei speichern. Wählen Sie dann unter Durchsuchen eine Datei aus, in der das Bild gespeichert werden soll, und geben Sie den Dateinamen ein.Wählen Sie als Nächstes auf der Registerkarte Z die Option Symmetrischer Modus definiert durch Bereich aus. Setzen Sie den Fokus auf die beste Karte mit zwei Ebenen und klicken Sie auf die Schaltfläche Relativ, um diese Fokusebene als Mitte des Z-Stapels festzulegen. Stellen Sie als Nächstes den Bereich auf fünf Mikrometer mit einem Mikrometerschritt ein und aktivieren Sie Close active Shutter während der Z-Bewegung.Wählen Sie auf der Registerkarte Wellenlänge unter Optische Konfiguration den Namen der optischen Schaltfläche mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen aus und klicken Sie auf Jetzt ausführen. Wählen Sie für geschnittenes Gewebe im Aufnahmemenü die Option "Großes Bild scannen" und wählen Sie dann im Aufnahmebereich die optische Taste mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen aus. Wählen Sie in diesem Bedienfeld auch das richtige Ziel aus.Verwenden Sie als Nächstes unter dem Bereichsfenster und dem Okular die Pfeiltasten, um die Grenzen der Region von Interesse oder des ROI festzulegen. Klicken Sie dann auf Großes Bild in Datei speichern und erstellen Sie einen Speicherpfad-Dateinamen für das Bild. Stellen Sie abschließend im Setup-Bedienfeld sicher, dass Multichannel Capture aktiviert ist.Wählen Sie dann unter Optische Konfiguration den Namen der optischen Taste mit den zuvor konfigurierten Erfassungseinstellungen. Öffnen Sie in ImageJ die Schwellenwertoption, indem Sie zum Bildmenü gehen, auf Anpassen und dann auf Schwellenwert klicken. Wählen Sie die Option "Dunkler Hintergrund", wenn das Bild einen dunklen Hintergrund hat.Passen Sie als Nächstes die oberen und unteren Grenzen des Schwellenwerts gemäß den zuvor festgelegten optimierten Schwellenwerteinstellungen an und klicken Sie auf Übernehmen. Verwenden Sie für kultivierte Zellen den MAP2-Kanal und ein ROI-Tool für freie Hand, um einen ROI für jedes Neuron zu zeichnen, einschließlich Dendriten und Soma. Zeichnen Sie für geschnittenes Gewebe einen ROI mit freier Hand innerhalb des Slice-Bildes, der den interessierenden Bereich kapselt.Rufen Sie dann den Bereich des ROI ab, indem Sie das Menü Analysieren öffnen und auf Messen klicken. Um die Anzahl der Punta innerhalb jedes ROI zu ermitteln, verwenden Sie ein automatisches Erkennungstool wie die Partikelanalyse. Wählen Sie im Menü Analysiert die Option Analysierte Partikel und definieren Sie den Durchmesser der Punctagröße.Wählen Sie als Nächstes aus dem Dropdown-Menü Show die Option Overlay Masks, aktivieren Sie dann die Option Ergebnisse anzeigen und klicken Sie auf OK. Um die Anzahl der Punta durch die Fläche des einzelnen ROI zu teilen, kopieren Sie die Ergebnisse für jedes Bild aus dem Ergebnis-Popup und fügen Sie sie in eine Tabelle ein. Identifizieren Sie, aus welcher Datei und Stichprobe die Daten stammen, aus denen wir stammen, und teilen Sie den Bereich des ROI durch die Anzahl der Punta.Um schließlich die Ergebnisse auf Kontrollproben zu normalisieren, werden die Ergebnisse für die Kontrollproben gemittelt und die erhaltenen Ergebnisse aller Proben durch den Durchschnitt der Kontrollprobe dividiert. Der GABAB-Agonist Baclofen wird für die In-vitro-Wirksamkeit des schnellen Antidepressivums Ro-256981 benötigt. Eine Zunahme der Synapsenbildung wird durch eine Zunahme der weißen Punta nachgewiesen.Ohne Baclofen ist keine Zunahme der Synapsenbildung zu sehen. In vivo führt die intraperitoneale Injektion des schnellen Antidepressivums zu einer Zunahme der Synapsenbildung im Vergleich zur Kochsalzkontrolle. Während einige Punta in den technischen Kontrollbildern erscheinen, haben sie im Allgemeinen nicht die gleiche Größe, wie die weiße Spezifikation zeigt, verglichen mit der großen Punta in den anderen Panels.Außerdem befinden sich diese Punta nicht an der gleichen Stelle, wie einige Punta zeigen, die innerhalb des Soma erscheinen. DetectSyn kann Veränderungen an Synapsen aufgrund eines Krankheitszustands oder einer medikamentösen Behandlung erkennen. Diese Methode kann dazu beitragen, Einblicke in jedes Forschungsgebiet zu geben, das die Störungen untersucht, die die Entwicklung oder den Abbau von Synapsen beeinflussen.

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Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluoreszierende Visualisierung von Mango-markierter RNA in Polyacrylamidgelen über eine Poststaining-Methode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Schnelle und kostengünstige RNA-Extraktion von Ratten-Pankreasgewebe

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Zellfraktionierung von U937-Zellen durch isopyknische Dichtegradientenreinigung

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...