Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NINDS R01 NS105005 (KRG) ו- NS105005-03S1 (KRG), משרד ההגנה USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), ומענק ממחקר FRAXA (CFH) ואיגוד האלצהיימר, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

בידודם של תאים ורקמות מבעלי חיים נעשה בהתאם למדריך של המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן ואושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בוויק פורסט
הערה: פרוטוקול זה משמש בדגימות שכבר טופלו וקבועות לפי פרדיגמות ודרישות ניסיוניות ספציפיות. למטרו...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn הוא מבחן מהיר המשתמש במבחן קשירת קרבה כדי לזהות חלבונים בטווח של 40 ננומטר זה מזה, מה שמאפשר זיהוי של היווצרות סינפסות. טכניקה זו משפרת את המבחנים הפלואורסצנטיים הנוכחיים, המשמשים רק כמדידות פרוקסי להיווצרות סינפסות. DetectSyn מזהה שינויים הניתנים לכימות בחלבונים סינפטיים הממוקמים בטווח...

סינפסות הן יחידת התקשורת הבסיסית בין נוירונים1. סינפסות רבות בין נוירונים באותם אזורים יוצרות מעגלים המתווכים התנהגות2. סינפסות מורכבות ממסוף קדם-סינפטי מתא עצב אחד המשחרר מוליכים עצביים או נוירופפטידים המעבירים מידע לקולטנים פוסט-סינפטיים של נוירון אחר. הסיכום של אותות קדם-סינפטיים קובע אם הנוירון הפוסט-סינפטי יפעיל פוטנציאל פעולה ויפיץ את המסר לנוירונים אחרים.
סינפטופתולוגיה, פירוק הסינפסות, מתעוררת במחלות ובהפרעות המסומנות בירידה בנפח העצבי, כמו מחלת אלצהיימר והפרעת דיכאון מז'ורי, וכתוצאה מכך מעגלים שכבר אינם מבצעים באופן אופטימלי 3,4,5. שחזור צפיפות הסינפסה ככל הנראה עומד בבסיס היעילות של טיפולים פוטנציאליים להפרעות אלה. לדוגמה, לאחרונה הוכח כי הגדלת הסינפסות עומדת בבסיס היעילות ההתנהגותית של תרופות נוגדות דיכאון מהירות6. כדי לסנן במהירות טיפולים סינפטופתולוגיים אפשריים, חוקרים זקוקים לטכניקות שמזהות במהירות שינויים במספרי הסינפסות.
המתודולוגיות הנוכחיות גוזלות זמן רב ויקרות (מיקרוסקופיית אלקטרונים, טומוגרפיה של מערך), או שהן בוחנות רק שינויים פוסט-סינפטיים מבלי לשלב מעורבות קדם-סינפטית (ניתוח עמוד שדרה, אימונופלואורסצנציה/קולוקליזציה). צבעים כמו DiI או חלבונים פלואורסצנטיים כמו GFP עוזרים לדמיין נוירונים ולאפיין עמודי שדרה פוסט-סינפטיים. עם זאת, ניתוח עמוד השדרה משתמש ביחסים המוגדרים על ידי חוקר כדי לקבוע מורפולוגיה, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול7. יתר על כן, האופן שבו שיעורי עמוד השדרה השונים מתייחסים לסינפסות תפקודיות עדיין נחשף8. היווצרות עמוד השדרה יכולה להיות חולפת ועשויה לשקף פלסטיות פוסט-סינפטית, אך ניתן לסלק את הקוצים האלה לפני שהם מתייצבים לסינפסה עם נוירון קדם-סינפטי9.
קולוקליזציה מספקת פרוקסי טוב יותר לסינפסות מאשר ניתוח עמוד שדרה מכיוון שניתן להגן על חיסונים עבור חלבונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים. עם זאת, חלבונים סינפטיים עשויים להניב ערכי קולוקליזציה נמוכים מכיוון שהחלבונים משתלבים זה בזה וייתכן שאינם חופפים באופן עקבי. לפיכך, מכיוון שהחלבונים אינם עליונים לחלוטין, טכניקות קולוקליזציה עשויות שלא למדוד במדויק שינויים בהיווצרות הסינפסה בשל מידע חסר זה. לבסוף, למרות שגם מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) וגם טומוגרפיה של מערך מספקים תמונות ברזולוציה גבוהה של סינפסות, הן גוזלות זמן רב. EM דורש גם ציוד מיוחד, והחוקרים מוגבלים לכמויות קטנות של רקמות עבור כל ניסוי נתון. בעוד שטומוגרפיה של מערך מספקת באלגנטיות את היכולת לסנן חלבונים רבים על מקטעי אולטרה-טווין וניתן לשלב אותה עם EM10, טכניקה זו עשויה להיות עתירת עבודה מדי ומעבר להיקף הניסויים שצריכים לסרוק במהירות אחר שינויים ביצירת סינפסות.
DetectSyn הוא יישום ספציפי של מבחן הליגה של קרבת דואולינק. בדיקת PLA מאפשרת זיהוי כללי של אינטראקציות חלבון-חלבון. DetectSyn מגשר על מדדים פוסט-סינפטיים של פרוקסי על-ידי הגברת אות פלואורסצנטי הנפלט על-ידי חלבונים מתויגים לפני ואחרי-סינפטיים בטווח של 40 ננומטר זה מזה. אם החלבונים הסינפטיים נמצאים בטווח של 40 ננומטר, כמו בתוך שסע סינפטי, אז הנוגדנים המשניים, המכילים בדיקות דנ"א, יתאיימו לדנ"א מעגלי. הדנ"א המעגלי ההיברידי הזה מבטא בדיקה פלואורסצנטית, שלאחר מכן מוגברת ומתגלה באמצעות טכניקות סטנדרטיות של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית (ראו איור 1). באופן מכריע, שלא כמו EM וטומוגרפיה של מערך, טכניקה זו אינה דורשת ציוד מיוחד ולוקחת בערך את אותה כמות זמן כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית. הנגישות של טכניקה זו, אם כן, מאפשרת לחוקרים מחוץ למוסדות עתירי מחקר להשתתף במחקר סינאפתולוגי. יתר על כן, טכניקה זו יכולה לבחון שינויים בצפיפות הסינפטית באזורי מוח מרובים בניסוי אחד, ומציעה ייצוג הוליסטי יותר של שינויים סינפטיים עקב מחלה או טיפול.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

סינפסות הן אתר התקשורת בין נוירונים. חוזק המעגל העצבי קשור לצפיפות הסינפטית, והתפרקות הסינפסות אופיינית למצבי מחלה כמו הפרעת דיכאון מז'ורי (MDD) ומחלת אלצהיימר. טכניקות מסורתיות לחקר מספרי סינפסות כוללות ביטוי גנטי של סמנים פלואורסצנטיים (למשל, חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)), צבעים הממלאים נוירון (למשל, צבע קרבוציאנין, DiI), וזיהוי אימונופלואורסצנטי של סמני עמוד שדרה (למשל, צפיפות פוסט-סינפטית 95 (PSD95)). אזהרה מרכזית לטכניקות פרוקסי אלה היא שהן מזהות רק שינויים פוסט-סינפטיים. עם זאת, סינפסה היא חיבור בין מסוף קדם-סינפטי לבין עמוד שדרה פוסט-סינפטי. תקן הזהב למדידת היווצרות/חיסול סינפסות דורש מיקרוסקופיית אלקטרונים גוזלת זמן רב או טכניקות טומוגרפיה של מערך. טכניקות אלה דורשות הכשרה מיוחדת וציוד יקר. יתר על כן, רק מספר מוגבל של נוירונים ניתן להעריך והם משמשים כדי לייצג שינויים באזור שלם במוח. DetectSyn היא טכניקה פלואורסצנטית מהירה המזהה שינויים בהיווצרות או חיסול סינפסות עקב מצב מחלה או פעילות תרופתית. DetectSyn משתמשת במבחן קשירת קרבה מהיר כדי לזהות חלבונים טרום-סינפטיים ופוסט-סינפטיים מעוותים ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, טכניקה הזמינה בקלות לרוב המעבדות. זיהוי פלואורסצנטי של הפנקטה המתקבלת מאפשר ניתוח מהיר ובלתי מוטה של ניסויים. DetectSyn מספקת תוצאות מייצגות יותר ממיקרוסקופיית אלקטרונים מכיוון שניתן לנתח אזורים גדולים יותר מאשר מספר מוגבל של נוירונים פלואורסצנטיים. יתר על כן, DetectSyn עובד עבור נוירונים בתרבית במבחנה ופרוסות רקמה קבועות. לבסוף, מסופקת שיטה לניתוח הנתונים שנאספו מטכניקה זו. באופן כללי, DetectSyn מציעה הליך לאיתור שינויים יחסיים בצפיפות הסינפסה בין טיפולים או מצבי מחלה, והיא נגישה יותר מטכניקות מסורתיות.

נתונים ששונו מ- Heaney et al.6 מוצגים כדי להדגים ניסוי שבו צפויה היווצרות סינפסה מוגברת (ראה6 למידע נוסף ודיון מעמיק יותר במנגנון). בעבר, הוכח כי תרופות נוגדות דיכאון מהירות דורשות הפעלה של הקולטן המטבוטרופי המעכב, GABAB (תת-סוג של חומצה גמא-אמינו-בוטירית B), כדי להיות יעיל<sup...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn הוא בדיקה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת המודדת שינויים במספר הסינפסות היחסי (טרום ופוסט-סינפטי) בין טיפולים או מצבי מחלה. טכניקה זו משתמשת בטכניקת קשירת קרבה שניתן להשתמש בה הן בתאי עצב בתרבית והן ברקמות קבועות.

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn מנצל את טכנולוגיית בדיקת קשירת הקרבה כדי לזהות במהירות שינויים בסינפסות. אנו מספקים גם פרוטוקול לניתוח התוצאות. היתרון העיקרי של DetectSyn הוא כמה מהר ניתן להשיג את התוצאות באזורים הגדולים של רקמות שניתן לנתח.כדי להתחיל, בזהירות להסיר את הפתרון חוסם עם פיפטה פסטר פלסטיק מבלי להפריע לתאים. לאחר מכן מרפדים צלחת פטרי גדולה מפלסטיק עם פרפילם. ובאמצעות מלקחיים, מעבירים בזהירות את תלושי הכיסוי לפארפילם.הוסיפו 60 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים הראשונית לחלק העליון של פתק הכיסוי, כדי להבטיח שפתרון הנוגדנים לא יישפך על דפנות תלוש הכיסוי. כדי לספק לחות ולמנוע ייבוש דגימות במהלך הדגירה, הוסיפו מים אולטרה-פוריים לצלחת פטרי קטנה יותר, והניחו בזהירות את התבשיל סביב תלושי הכיסוי. לאחר מכן מכסים את צלחת הפטרי הגדולה יותר ומדגרים את התאים בתרבית למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר הדגירה עם הנוגדן הראשוני, השתמשו במלקחיים כדי להקיש בזהירות על תמיסת הנוגדן הראשונית מתוך תמיסת הכיסוי על מגבת נייר ולהעביר את תלושי הכיסוי לצלחת המקורית שלהם בת 24 הבארות המלאה ב-500 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם PBS שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם תסיסה עדינה על שייקר מסלול. לאחר הדחיפה האחרונה, העבירו את החלקות הכיסוי בחזרה לצלחת הפטרי הגדולה והוסיפו 40 מיקרוליטרים של תמיסת הנוגדנים המשנית לחלק העליון של החלקת הכיסוי.מכסים את צלחת הפטרי ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. לצורך קשירת קשר, תוך שמירה על הליגאז על בלוק קר, דיללו את הליגאז 1 עד 40 באמצעות מלאי הליגציה והוסיפו מיד 40 מיקרוליטרים של תערובת הליגאזות למחליקי הכיסוי. מכסים את צלחת הפטרי ומדגרים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.להגברה, דיללו את הפולימראז 1280 על בלוק קר באמצעות מלאי ההגברה. לאחר מכן הוסיפו 40 מיקרוליטרים של תערובת ההגברה לתלושי הכיסוי ודגרו את הדגימות במשך 100 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להרכבה, שחרר שלושה מיקרוליטרים של מדיית הרכבה על שקופית.הקש על מאגר שטיפה עודף מהחלקת הכיסוי והנח את החלקת הכיסוי עם תאים הפונים כלפי מטה לתוך אמצעי ההרכבה. אטמו את הדפנות בכמות קטנה של לק שקוף כדי להחזיק את החלקת הכיסוי במקומה. להרכבה של רקמות פרוסות, מעבירים בזהירות פרוסת טישו למגלשה המוכנה ומניחים אותה שטוחה.לאחר מכן שחררו 5 עד 10 מיקרוליטרים של אמצעי הרכבה על פרוסת הרקמה. מניחים כיסוי זכוכית מעל פרוסת הרקמה ואוטמים את החלקת הכיסוי בלק שקוף, כפי שהודגם קודם לכן. להדמיה דיגיטלית עם מיקרוסקופ קונפוקלי, התאימו את כוח הרווח, ההסטה והלייזר עבור כל ערוץ פלואורסצנטי כדי להפחית את רעשי הרקע ולשפר את האות הפלואורסצנטי.ודא שהאות הפלואורסצנטי אינו רווי יתר על המידה. עבור נוירוני התרבות, תחת הכרטיסיה רכישת ND, לחץ על שמור בקובץ. לאחר מכן, תחת עיון, בחר קובץ לשמירת התמונה והזן את שם הקובץ.לאחר מכן, תחת הכרטיסיה Z, בחר באפשרות מצב סימטרי המוגדר על ידי טווח. הגדר את המיקוד למפה הטובה ביותר בשני מישורים ולחץ על הלחצן 'יחסי' כדי להגדיר את מישור המוקד הזה כמרכז מחסנית z. לאחר מכן, הגדר את הטווח לחמישה מיקרומטרים עם צעד אחד של מיקרומטר ובדוק סגור תריס פעיל במהלך תנועת Z.תחת הכרטיסייה אורך גל, בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת תצורה אופטית ולחץ על הפעל כעת. עבור רקמות פרוסות, מתפריט הרכישה בחר סרוק תמונה גדולה, ולאחר מכן תחת לוח הלכידה, בחר בלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו קודם לכן. כמו כן, בחר את המטרה הנכונה בחלונית זו.לאחר מכן, מתחת ללוח האזור ולפיסת העין, השתמש במקשי החצים כדי להגדיר את גבולות אזור העניין או ההחזר על ההשקעה. לאחר מכן לחץ על שמור תמונה גדולה לקובץ וצור שם קובץ נתיב שמירה עבור התמונה. לבסוף, תחת לוח ההתקנה, ודא כי לכידה רב-ערוצית נבדקת.לאחר מכן בחר את שם הלחצן האופטי עם הגדרות הרכישה שהוגדרו בעבר תחת תצורה אופטית. ב- ImageJ, פתח את אפשרות הסף על-ידי מעבר לתפריט התמונה, לחיצה על התאם ולאחר מכן על סף. בחר באפשרות רקע כהה אם התמונה כוללת רקע כהה.לאחר מכן, התאם את הגבולות העליונים והתחתונים של הסף לפי הגדרות הסף הממוטבות שנקבעו בעבר ולחץ על החל. עבור תאים בתרבית, השתמש בתעלת MAP2 ובכלי החזר השקעה ביד חופשית כדי למשוך החזר על ההשקעה עבור כל נוירון, כולל דנדריטים וסומה. עבור רקמות פרוסות, ציירו החזר על ההשקעה ביד חופשית בתוך תמונת הפרוסה שמתמצתת את תחום העניין.לאחר מכן השג את האזור של ההחזר על ההשקעה על-ידי פתיחת תפריט ניתוח ולחיצה על מדוד. כדי לזהות את מספר הפונטה בתוך כל ROI, השתמש בכלי זיהוי אוטומטי כמו ניתוח חלקיקים. מתפריט 'מנותח', בחר 'חלקיקים מנותחים' והגדר את קוטר גודל הפונקטה.לאחר מכן, מהתפריט הנפתח 'הצג', בחר באפשרות מסיכות שכבה-על ולאחר מכן בדוק את האפשרות הצג תוצאות ולחץ על ״בסדר״. כדי לחלק את מספר הפונטה באזור ההחזר על ההשקעה הבודד, העתק והדבק את התוצאות עבור כל תמונה מהתוצאות שצצו לגיליון אלקטרוני. זהה באיזה קובץ ודגם את הנתונים שמהם אנו מקבלים, וחלק את שטח ההחזר על ההשקעה במספר הפונטה.לבסוף, כדי לנרמל את התוצאות כדי לשלוט בדגימות, ממוצע התוצאות עבור דגימות הבקרה וחלוק את התוצאות המתקבלות של כל הדגימות בממוצע של הפקד. האגוניסט GABAB, בקלופן, נדרש ליעילות במבחנה של התרופה נוגדת הדיכאון המהירה Ro-256981. עלייה בהיווצרות הסינפסות מודגמת על ידי עלייה בפונטה הלבנה.ללא בקלופן, לא נראית עלייה בהיווצרות הסינפסות. In vivo, הזרקה תוך-צפקית של התרופה נוגדת הדיכאון המהירה גורמת לעלייה בהיווצרות הסינפסות בהשוואה לבקרת המלח. בעוד שחלק מהפונטה מופיעים בתמונות הבקרה הטכנית, הם בדרך כלל אינם באותו גודל כפי שהודגם על ידי המפרט הלבן בהשוואה לפונטה הגדולה בלוחות האחרים.יתר על כן, פונטה אלה אינם נמצאים באותו מקום כפי שהודגם על ידי פונטה כלשהי המופיעה בתוך הסומא. DetectSyn יכול לזהות שינויים בסינפסות עקב מצב מחלה או טיפול תרופתי. שיטה זו יכולה לעזור לספק תובנה לכל תחום מחקר החוקר את ההפרעות המשפיעות על התפתחות או התמוטטות של סינפסות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

ליזר מהיר גשוש שיטה מקלה על קביעת פולשני צור-חינם של תכונות תרמיות ליף

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

הגברה איזותרמי מרובבת מבוסס פלטפורמת אבחון לאיתור Zika Chikungunya, קדחת דנגה 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

פיצול תאים של תאי U937 על ידי טיהור הדרגתי בצפיפות איזופיקנית

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...