Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान NINDS R01 NS105005 (KRG) और NS105005-03S1 (KRG), रक्षा विभाग USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) और FRAXA-201 से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

जानवरों से कोशिकाओं और ऊतकों का अलगाव प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान की मार्गदर्शिका के अनुसार था और वेक वन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमो?...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn एक तेजी से परख है कि एक निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए, जो synapse गठन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए है. यह तकन?...

Synapses न्यूरॉन्स1 के बीच संचार की मौलिक इकाई हैं। एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स के बीच कई synapses सर्किट है कि मध्यस्थता व्यवहार2 को जन्म देते हैं. Synapses एक न्यूरॉन से एक presynaptic टर्मिनल से मिलकर बनता है जो न्यूरोट्रांसमीटर या न्यूरोपेप्टाइड्स जारी करता है जो किसी अन्य न्यूरॉन के पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स को जानकारी रिले करता है। प्रीसिनेप्टिक संकेतों का योग यह निर्धारित करता है कि क्या पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन एक एक्शन पोटेंशियल को आग लगाएगा और संदेश को अन्य न्यूरॉन्स को प्रचारित करेगा।
Synaptopathology, synapses का टूटना, बीमारियों और विकारों में उत्पन्न होता है जो अल्जाइमर रोग और प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार जैसे कम तंत्रिका मात्रा से चिह्नित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सर्किट होते हैं जो अब 3,4,5 का प्रदर्शन नहीं करते हैं। Synapse घनत्व बहाल करने की संभावना इन विकारों के लिए संभावित उपचार की प्रभावकारिता underlies. उदाहरण के लिए, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया था कि synapses में वृद्धि तेजी से antidepressants6 की व्यवहारिक प्रभावकारिता underlies. तेजी से संभव synaptopathology उपचार स्क्रीन करने के लिए, शोधकर्ताओं को तकनीकों की आवश्यकता होती है जो जल्दी से synapse संख्याओं में परिवर्तन की पहचान करते हैं।
वर्तमान तरीके या तो समय लेने वाली और महंगी हैं (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, सरणी टोमोग्राफी), या वे केवल प्रीसिनैप्टिक सगाई (रीढ़ का विश्लेषण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस / कोलोकलाइजेशन) को शामिल किए बिना पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की जांच करते हैं। डीआईआई या जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे रंजक न्यूरॉन्स की कल्पना करने में मदद करते हैं और पोस्टसिनेप्टिक स्पाइन को चिह्नित करते हैं। हालांकि, रीढ़ का विश्लेषण आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए शोधकर्ता-परिभाषित अनुपात का उपयोग करता है, जो पुनरुत्पादन क्षमता को कम कर सकताहै 7। इसके अलावा, विभिन्न रीढ़ की हड्डी कक्षाएं कार्यात्मक synapses से कैसे संबंधित हैं, यह अभी भी उजागर किया जा रहा है8। रीढ़ की हड्डी का गठन क्षणिक हो सकता है और पोस्टसिनेप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रतिबिंबित कर सकता है, लेकिन इन रीढ़ को प्रीसिनैप्टिक न्यूरॉन 9 के साथ एक सिनैप्स में स्थिर करने से पहले समाप्त किया जा सकताहै।
Colocalization रीढ़ की हड्डी के विश्लेषण की तुलना में synapses के लिए एक बेहतर प्रॉक्सी प्रदान करता है क्योंकि कोई भी प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक प्रोटीन के लिए immunostain कर सकता है। हालांकि, सिनैप्टिक प्रोटीन कम कोलोकलाइजेशन मूल्यों को उत्पन्न कर सकते हैं क्योंकि प्रोटीन जुदा होता है और लगातार ओवरलैप नहीं हो सकता है। इस प्रकार, क्योंकि प्रोटीन पूरी तरह से अतिरंजित नहीं हैं, इसलिए कोलोकलाइजेशन तकनीकइस लापता जानकारी के कारण सिनैप्स गठन में परिवर्तनों को सटीक रूप से माप नहीं सकती है। अंत में, हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) और सरणी टोमोग्राफी दोनों synapses की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करते हैं, वे समय लेने वाले हैं। ईएम को आगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और शोधकर्ता किसी भी दिए गए प्रयोग के लिए ऊतक की छोटी मात्रा तक सीमित होते हैं। जबकि सरणी टोमोग्राफी सुरुचिपूर्ण रूप से अल्ट्राथिन वर्गों पर कई प्रोटीनों के लिए स्क्रीन करने की क्षमता प्रदान करती है और ईएम10 के साथ संयुक्त की जा सकती है, यह तकनीक बहुत श्रम-गहन और प्रयोगों के दायरे से परे हो सकती है जिन्हें सिनैप्स गठन में परिवर्तन के लिए तेजी से स्कैन करने की आवश्यकता होती है।
DetectSyn Duolink निकटता बंधाव परख का एक विशिष्ट आवेदन है. पीएलए परख प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का सामान्य पता लगाने के लिए अनुमति देता है। डिटेक्टसिन पुलों प्रॉक्सी postsynaptic उपायों को एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर टैग पूर्व और postsynaptic प्रोटीन टैग द्वारा उत्सर्जित एक फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने के द्वारा उपायों. यदि सिनैप्टिक प्रोटीन 40 एनएम के भीतर हैं, जैसा कि एक सिनैप्टिक फांक के भीतर है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी, जिसमें डीएनए जांच होती है, परिपत्र डीएनए में संकरित हो जाएगी। यह संकरित परिपत्र डीएनए एक फ्लोरोसेंट जांच को व्यक्त करता है, जिसे तब मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ प्रवर्धित और पता लगाया जाता है ( चित्रा 1 देखें)। महत्वपूर्ण रूप से, ईएम और सरणी टोमोग्राफी के विपरीत, इस तकनीक को विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के समान समय लगता है। इस तकनीक की पहुंच, इस प्रकार, अनुसंधान-गहन संस्थानों के बाहर के जांचकर्ताओं को सिनैप्टोपैथोलॉजी अनुसंधान में भाग लेने में सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह तकनीक एक ही प्रयोग के भीतर कई मस्तिष्क क्षेत्रों में सिनैप्टिक घनत्व में परिवर्तन की जांच कर सकती है, जो बीमारी या उपचार के कारण सिनैप्टिक परिवर्तनों का अधिक समग्र प्रतिनिधित्व प्रदान करती है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapses न्यूरॉन्स के बीच संचार की साइट हैं। न्यूरोनल सर्किट ताकत सिनैप्टिक घनत्व से संबंधित है, और synapses का टूटना प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार (एमडीडी) और अल्जाइमर रोग जैसे रोग राज्यों की विशेषता है। Synapse संख्याओं की जांच करने के लिए पारंपरिक तकनीकों में फ्लोरोसेंट मार्करों की आनुवंशिक अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)), रंजक जो एक न्यूरॉन (जैसे, कार्बोसाइनिन डाई, DiI) को भरते हैं, और रीढ़ मार्करों का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन (उदाहरण के लिए, पोस्टसिनेप्टिक घनत्व 95 (PSD95)) शामिल हैं। इन प्रॉक्सी तकनीकों के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि वे केवल पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की पहचान करते हैं। फिर भी, एक synapse एक presynaptic टर्मिनल और एक postsynaptic रीढ़ के बीच एक कनेक्शन है। सिनैप्स गठन / उन्मूलन को मापने के लिए सोने के मानक को समय लेने वाली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सरणी टोमोग्राफी तकनीकों की आवश्यकता होती है। इन तकनीकों के लिए विशेष प्रशिक्षण और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, केवल सीमित संख्या में न्यूरॉन्स का मूल्यांकन किया जा सकता है और इसका उपयोग पूरे मस्तिष्क क्षेत्र में परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जाता है। DetectSyn एक तेजी से फ्लोरोसेंट तकनीक है जो एक रोग की स्थिति या दवा गतिविधि के कारण synapse गठन या उन्मूलन में परिवर्तन की पहचान करती है। DetectSyn एक तेजी से निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है juxtaposed पूर्व और postsynaptic प्रोटीन और मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का पता लगाने के लिए, एक तकनीक आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध है. परिणामी puncta के फ्लोरोसेंट पता लगाने प्रयोगों के त्वरित और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. DetectSyn इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है क्योंकि फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स की सीमित संख्या की तुलना में बड़े क्षेत्रों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, DetectSyn इन विट्रो सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक स्लाइस के लिए काम करता है। अंत में, इस तकनीक से एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है। कुल मिलाकर, DetectSyn उपचार या रोग राज्यों में synapse घनत्व में सापेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करता है और पारंपरिक तकनीकों की तुलना में अधिक सुलभ है।

Heaney et al.6 से संशोधित डेटा को एक प्रयोग का प्रदर्शन करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है जहां सिनैप्स गठन में वृद्धि की उम्मीद की जाती है (कृपया अधिक जानकारी के लिए6 देखें और तंत्र की अधिक गहरा...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn एक निष्पक्ष, तेजी से फ्लोरोसेंट परख है कि उपचार या रोग राज्यों भर में रिश्तेदार synapse (पूर्व और postsynaptic सगाई) संख्या में परिवर्तन को मापता है. यह तकनीक एक निकटता बंधन तकनीक का उपयोग करती है जिसका उपयोग सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक दोनों में किया जा सकता है।

DetectSyn: Synapse घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक त्वरित, निष्पक्ष फ्लोरोसेंट विधि

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn निकटता बंधाव परख प्रौद्योगिकी का लाभ लेने के लिए जल्दी से synapses करने के लिए परिवर्तन की पहचान करता है. हम परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैं। DetectSyn का मुख्य लाभ यह है कि ऊतक के बड़े क्षेत्रों में परिणाम कितनी जल्दी प्राप्त किए जा सकते हैं जिनका विश्लेषण किया जा सकता है।शुरू करने के लिए, कोशिकाओं को परेशान किए बिना एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ ब्लॉकिंग समाधान को सावधानीपूर्वक हटा दें। फिर पैराफिल्म के साथ एक बड़े प्लास्टिक पेट्री डिश को लाइन करें। और संदंश का उपयोग करते हुए, ध्यान से कवर स्लिप को पैराफिल्म में स्थानांतरित करें।कवर स्लिप के शीर्ष पर प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 60 माइक्रोलीटर जोड़ें, यह सुनिश्चित करते हुए कि एंटीबॉडी समाधान कवर स्लिप के किनारों पर नहीं फैलता है। आर्द्रता प्रदान करने और इनक्यूबेशन के दौरान नमूनों को सूखने से रोकने के लिए, एक छोटे पेट्री डिश में अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें, और ध्यान से कवर स्लिप के चारों ओर पकवान रखें। फिर बड़े पेट्री डिश को कवर करें और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए सुसंस्कृत कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद, एक पेपर तौलिया पर कवर स्लिप से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को ध्यान से टैप करने के लिए संदंश का उपयोग करें और पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर से भरे अपने मूल 24-वेल प्लेट में कवर स्लिप को स्थानांतरित करें। फिर पीबीएस के साथ नमूनों को 10 मिनट के लिए तीन बार धोएं, प्रत्येक कक्षीय शेकर पर कोमल आंदोलन के साथ। अंतिम धोने के बाद, कवर स्लिप को बड़े पेट्री डिश में वापस स्थानांतरित करें और कवर स्लिप के शीर्ष पर माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें।पेट्री डिश को कवर करें और एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें। बंधाव के लिए, एक ठंडे ब्लॉक पर लिगाज़ रखते हुए, लिगेशन स्टॉक का उपयोग करके लिगेज 1 से 40 को पतला करें और तुरंत कवर स्लिप में लिगेज़ मिश्रण के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। पेट्री डिश को कवर करें और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।प्रवर्धन के लिए, प्रवर्धन स्टॉक का उपयोग करके ठंडे ब्लॉक पर पोलीमरेज़ 1280 को पतला करें। फिर कवर स्लिप में प्रवर्धन मिश्रण के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 100 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट करें। अगला, बढ़ते के लिए, एक स्लाइड पर बढ़ते मीडिया के तीन माइक्रोलीटर ड्रॉप करें।कवर स्लिप से अतिरिक्त धोने बफर को टैप करें और बढ़ते मीडिया में नीचे की ओर सामना करने वाली कोशिकाओं के साथ कवर स्लिप रखें। कवर स्लिप को जगह में रखने के लिए स्पष्ट नेल पॉलिश की एक छोटी राशि के साथ पक्षों को सील करें। कटा हुआ ऊतक के बढ़ते के लिए, ध्यान से तैयार स्लाइड के लिए एक ऊतक टुकड़ा स्थानांतरित करें और इसे सपाट रखें।फिर ऊतक स्लाइस पर बढ़ते मीडिया के 5 से 10 माइक्रोलीटर ड्रॉप करें। ऊतक स्लाइस पर एक ग्लास कवर स्लिप रखें और स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर स्लिप को सील करें, जैसा कि पहले दिखाया गया है। एक confocal माइक्रोस्कोप के साथ डिजिटल इमेजिंग के लिए, पृष्ठभूमि शोर को कम करने और फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ाने के लिए प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए लाभ, ऑफसेट और लेजर शक्ति को समायोजित करें।सुनिश्चित करें कि फ्लोरोसेंट सिग्नल ओवरसैचुरेटेड नहीं है। संस्कृति न्यूरॉन्स के लिए, एनडी अधिग्रहण टैब के तहत, फ़ाइल में सहेजें पर क्लिक करें। फिर ब्राउज़ करें के तहत, छवि को सहेजने और फ़ाइल नाम इनपुट करने के लिए एक फ़ाइल चुनें।अगला, Z टैब के अंतर्गत, श्रेणी द्वारा निर्धारित सममित मोड विकल्प का चयन करें. सबसे अच्छा नक्शा दो-विमान के लिए फोकस सेट करें और इस फोकल विमान को z-स्टैक के बीच के रूप में सेट करने के लिए सापेक्ष बटन पर क्लिक करें। अगला, एक माइक्रोमीटर चरणों के साथ पांच माइक्रोमीटर के लिए सीमा सेट करें और जेड आंदोलन के दौरान सक्रिय शटर बंद करें की जांच करें।तरंग दैर्ध्य टैब के तहत, ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन के तहत पहले से कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन के नाम का चयन करें और अब चलाएँ पर क्लिक करें। कटा हुआ ऊतक के लिए, अधिग्रहण मेनू से बड़ी छवि स्कैन करें चुनें, फिर कैप्चरिंग पैनल के तहत, पहले से कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन का चयन करें। इसके अलावा, इस पैनल में सही उद्देश्य का चयन करें।अगला, क्षेत्र पैनल और आंख के टुकड़े के तहत, ब्याज या आरओआई के क्षेत्र की सीमाओं को निर्धारित करने के लिए तीर कुंजियों का उपयोग करें। फिर फ़ाइल में बड़ी छवि सहेजें पर क्लिक करें और छवि के लिए एक सहेजें पथ फ़ाइल नाम बनाएँ। अंत में, सेटअप पैनल के तहत, सुनिश्चित करें कि Multichannel कैप्चर की जाँच की गई है।फिर ऑप्टिकल कॉन्फ़िगरेशन के तहत पहले से कॉन्फ़िगर की गई अधिग्रहण सेटिंग्स के साथ ऑप्टिकल बटन का नाम चुनें। ImageJ में, छवि मेनू पर जाकर, समायोजित करें पर क्लिक करके, और फिर थ्रेशोल्ड पर क्लिक करके थ्रेशोल्ड विकल्प खोलें. यदि छवि में एक अंधेरा पृष्ठभूमि है तो डार्क बैकग्राउंड विकल्प चुनें।अगला, पहले से निर्धारित अनुकूलित थ्रेशोल्ड सेटिंग्स के प्रति थ्रेशोल्ड की ऊपरी और निचली सीमाओं को समायोजित करें और लागू करें पर क्लिक करें। सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, प्रत्येक न्यूरॉन के लिए एक ROI खींचने के लिए MAP2 चैनल और एक मुक्त हाथ ROI उपकरण का उपयोग करें, जिसमें डेंड्राइट्स और सोमा शामिल हैं। कटा हुआ ऊतक के लिए, स्लाइस छवि के भीतर एक मुक्त हाथ आरओआई खींचें जो ब्याज के क्षेत्र को समाहित करता है।फिर विश्लेषण मेनू खोलने और माप पर क्लिक करके ROI के क्षेत्र को प्राप्त करें। प्रत्येक ROI के भीतर punta की संख्या का पता लगाने के लिए, कण विश्लेषण की तरह एक स्वचालित पहचान उपकरण का उपयोग करें। विश्लेषित मेनू से, विश्लेषित कणों का चयन करें और puncta आकार व्यास को परिभाषित करें।इसके बाद, शो ड्रॉप-डाउन मेनू से, ओवरले मास्क विकल्प चुनें, फिर प्रदर्शन परिणाम विकल्प की जांच करें और ठीक पर क्लिक करें। व्यक्तिगत ROI के क्षेत्र से punta की संख्या को विभाजित करने के लिए, एक स्प्रेडशीट में पॉप अप परिणामों से प्रत्येक छवि के लिए परिणामों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ। पहचानें कि हम किस फ़ाइल से प्राप्त डेटा और नमूना लेते हैं, और आरओआई के क्षेत्र को पुंटा की संख्या से विभाजित करें।अंत में, नमूनों को नियंत्रित करने के लिए परिणामों को सामान्य करने के लिए, नियंत्रण नमूनों के लिए परिणामों को औसत करें और नियंत्रण के औसत से सभी नमूनों के प्राप्त परिणामों को विभाजित करें। GABAB एगोनिस्ट, baclofen, तेजी से एंटीडिप्रेसेंट Ro-256981 की इन विट्रो प्रभावकारिता के लिए आवश्यक है। synapse गठन में वृद्धि सफेद punta में वृद्धि से प्रदर्शित किया जाता है।बैक्लोफेन के बिना, सिनैप्स गठन में कोई वृद्धि नहीं देखी जाती है। विवो में, तेजी से एंटीडिप्रेसेंट के इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के परिणामस्वरूप खारा नियंत्रण की तुलना में सिनैप्स गठन में वृद्धि होती है। जबकि कुछ punta तकनीकी नियंत्रण छवियों में दिखाई देते हैं, वे आम तौर पर एक ही आकार के रूप में अन्य पैनलों में बड़े punta की तुलना में सफेद कल्पना द्वारा प्रदर्शित नहीं कर रहे हैं.इसके अलावा, ये पुंटा उसी स्थान पर नहीं हैं जैसा कि सोमा के भीतर दिखाई देने वाले कुछ पुंटा द्वारा प्रदर्शित किया गया है। DetectSyn एक रोग की स्थिति या दवा उपचार के कारण synapses में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं। यह विधि अनुसंधान के किसी भी क्षेत्र को अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकती है जो सिनैप्स के विकास या टूटने को प्रभावित करने वाले विकारों का अध्ययन करती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

एक रैपिड लेजर जांच विधि पत्ता तापीय गुणों की गैर-आक्रामक और संपर्क मुक्त निर्धारण की सुविधा

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

मल्टीप्लेक्स इज़ोटेर्माल प्रवर्धन आधारित नैदानिक मंच Zika, Chikungunya, और डेंगू का पता लगाने के लिए 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

पौधों में लौह सामग्री को मापने के लिए एक वर्णमिति विधि

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

एक इन विट्रो परख tRNA-Isopentenyl ट्रांस्फ़्रेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

कैसे थोक में और जीने की कोशिकाओं में Photoactivated फ्लोरोसेंट प्रोटीन के अंश को बढ़ाता है

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

एक चूहा मिथाइल-Seq मंच तनाव जोखिम से जुड़े Epigenetic परिवर्तन की पहचान करने के लिए

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

पॉलीऐक्रिलमाइड जेल्स में एक पोस्टस्टेनिंग विधि के माध्यम से आम-टैग किए गए आरएनए का फ्लोरोसेंट विजुअलाइजेशन

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

चूहा अग्नाशय के ऊतकों की तेजी से और लागत प्रभावी आरएनए निष्कर्षण

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

आइसोपिनिक घनत्व ढाल शुद्धिकरण द्वारा यू 937 कोशिकाओं का सेल फ्रैक्शनेशन

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...