Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

이 연구는 국립 보건원 NINDS R01 NS105005 (KRG) 및 NS105005-03S1 (KRG), 국방부 USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), FRAXA 연구 (CFH) 및 알츠하이머 협회 AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG)의 보조금을 지원했습니다.

동물로부터 세포 및 조직을 분리하는 것은 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드에 따라 이루어졌으며 웨이크 포레스트 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
참고: 이 프로토콜은 특정 실험 패러다임 및 요구 사항에 따라 이미 처리되고 고정된 샘플에 사용됩니다. 시연 목적을 위해, 신속한 항우울제 처리로 인한 시냅스 형성이 시냅스 검출 ?...

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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn은 근접 결찰 분석을 사용하여 서로 40nm 이내의 단백질을 검출하는 신속한 분석으로, 시냅스 형성을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 시냅스 형성을위한 프록시 측정만으로 사용되는 현재의 형광 분석을 향상시킵니다. DetectSyn은 40 nm 이내, 즉 시냅스 구개열 내에서 국소화된 시냅스 단백질의 정량화 가능한 변화를 검출한다. 또한 DetectSyn은 시냅스를 측정하고 고전적으로 금 표준 기술로 지?...

시냅스는 뉴런 1 사이의 통신의 기본 단위입니다. 동일한 영역 내의 뉴런 사이의 많은 시냅스는 행동2를 매개하는 회로를 발생시킵니다. 시냅스는 다른 뉴런의 시냅스 후 수용체에 정보를 전달하는 신경 전달 물질 또는 신경 펩티드를 방출하는 하나의 뉴런에서 시냅스 전 말단으로 구성됩니다. 시냅스 전 신호의 합산은 시냅스 후 뉴런이 행동 잠재력을 발사하고 메시지를 다른 뉴런으로 전파할지 여부를 결정합니다.
시냅스의 분해 인 Synaptopathology는 알츠하이머 병 및 주요 우울 장애와 같은 신경 부피 감소로 인한 질병 및 장애에서 발생하며 더 이상 3,4,5를 최적으로 수행하지 않는 회로를 초래합니다. 시냅스 밀도를 복원하는 것은 이러한 장애에 대한 잠재적 인 치료법의 효능의 기초가 될 가능성이 큽니다. 예를 들어, 시냅스의 증가가 빠른 항우울제6의 행동 효능의 기초가 된다는 것이 최근에 입증되었다. 가능한 시냅스 병리학 치료를 신속하게 스크리닝하기 위해 연구자들은 시냅스 수의 변화를 신속하게 식별하는 기술이 필요합니다.
현재의 방법론은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들거나 (전자 현미경, 배열 단층 촬영), 시냅스 전 결합 (척추 분석, 면역 형광 / 공국소화)을 통합하지 않고 시냅스 후 변화 만 검사합니다. DiI와 같은 염료 또는 GFP와 같은 형광 단백질은 뉴런을 시각화하고 시냅스 후 척추를 특성화하는 데 도움이됩니다. 그러나 척추 분석은 연구자가 정의한 비율을 사용하여 형태학을 결정하며, 이는 재현성을 감소시킬 수 있습니다7. 또한, 상이한 척추 클래스가 기능적 시냅스와 어떻게 관련되는지는 여전히 밝혀지고 있다8. 척추 형성은 일시적일 수 있고 시냅스 후 가소성을 반영할 수 있지만, 이러한 척추는 시냅스 전 뉴런(9)을 갖는 시냅스로 안정화되기 전에 제거될 수 있다.
공국소화는 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 대한 면역염색을 할 수 있기 때문에 척추 분석보다 시냅스에 대한 더 나은 프록시를 제공합니다. 그러나, 시냅스 단백질은 단백질이 병치되어 있고 일관되게 겹치지 않을 수 있기 때문에 낮은 공동국소화 값을 산출할 수 있다. 따라서, 단백질이 완전히 중첩되지 않기 때문에, 공동국재화 기술은 이러한 누락된 정보로 인한 시냅스 형성의 변화를 정확하게 측정하지 못할 수 있다. 마지막으로, 전자 현미경 (EM)과 어레이 단층 촬영 모두 시냅스의 고해상도 이미지를 제공하지만 시간이 많이 걸립니다. EM은 또한 전문 장비를 필요로하며, 연구원은 주어진 실험을 위해 소량의 조직으로 제한됩니다. 배열 단층 촬영은 초박형 절편에서 많은 단백질을 선별 할 수있는 기능을 우아하게 제공하고 EM10과 결합 할 수 있지만,이 기술은 너무 노동 집약적이며 시냅스 형성의 변화를 신속하게 스캔해야하는 실험 범위를 벗어날 수 있습니다.
DetectSyn은 Duolink 근접 결찰 분석의 특정 응용 프로그램입니다. PLA 분석은 단백질-단백질 상호작용의 일반적인 검출을 허용한다. DetectSyn 브릿지는 서로 40 nm 내에서 태그가 지정된 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 의해 방출되는 형광 신호를 증폭하여 시냅스 후 측정을 브릿지합니다. 시냅스 단백질이 시냅스 구개열 내에서와 같이 40nm 이내에있는 경우, DNA 프로브를 포함하는 보조 항체는 원형 DNA로 혼성화됩니다. 이 혼성화된 원형 DNA는 형광 프로브를 발현하고, 이 프로브는 표준 형광 현미경 기술로 증폭 및 검출된다( 그림 1 참조). 결정적으로, EM 및 어레이 단층 촬영과는 달리,이 기술은 전문 장비를 필요로하지 않으며 표준 면역 조직 화학과 거의 동일한 시간이 걸립니다. 따라서이 기술의 접근성은 연구 집약적 인 기관 외부의 조사관이 시냅토 병리학 연구에 참여할 수있게합니다. 또한,이 기술은 단일 실험 내에서 여러 뇌 영역에서 시냅스 밀도의 변화를 조사 할 수 있으며, 질병 또는 치료로 인한 시냅스 변화의보다 전체적인 표현을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

시냅스는 뉴런 사이의 통신 부위입니다. 신경 회로 강도는 시냅스 밀도와 관련이 있으며, 시냅스의 분해는 주요 우울 장애 (MDD) 및 알츠하이머 병과 같은 질병 상태의 특징입니다. 시냅스 수를 조사하기 위한 전통적인 기술에는 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP))의 유전적 발현, 뉴런을 채우는 염료(예를 들어, 카르보시아닌 염료, DiI), 및 척추 마커의 면역형광 검출(예를 들어, 시냅스 후 밀도 95(PSD95))이 포함된다. 이러한 프록시 기술에 대한 주요 경고는 시냅스 후 변경 사항 만 식별한다는 것입니다. 그러나 시냅스는 시냅스 전 말단과 시냅스 후 척추 사이의 연결입니다. 시냅스 형성/제거를 측정하기 위한 황금 표준은 시간이 많이 소요되는 전자 현미경 또는 어레이 단층 촬영 기술이 필요합니다. 이러한 기술에는 전문 교육과 값 비싼 장비가 필요합니다. 또한, 제한된 수의 뉴런 만 평가할 수 있으며 전체 뇌 영역의 변화를 나타내는 데 사용됩니다. DetectSyn은 질병 상태 또는 약물 활동으로 인한 시냅스 형성 또는 제거의 변화를 식별하는 신속한 형광 기술입니다. DetectSyn은 신속한 근접 결찰 분석을 사용하여 병치된 시냅스 전후 단백질과 표준 형광 현미경을 검출하며, 이는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 기술입니다. 결과 누자의 형광 검출은 실험의 신속하고 편향되지 않은 분석을 가능하게합니다. DetectSyn은 제한된 수의 형광 뉴런보다 더 큰 영역을 분석 할 수 있기 때문에 전자 현미경보다 더 대표적인 결과를 제공합니다. 또한, DetectSyn은 시험관 내에서 배양된 뉴런 및 고정 조직 조각에 대해 작동합니다. 마지막으로, 이 기술로부터 수집된 데이터를 분석하는 방법이 제공된다. 전반적으로 DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸쳐 시냅스 밀도의 상대적 변화를 감지하는 절차를 제공하며 기존 기술보다 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.

Heaney et al.6에서 수정 된 데이터는 증가 된 시냅스 형성이 예상되는 실험을 입증하기 위해 제시됩니다 (메커니즘에 대한 자세한 정보와 심층적 인 논의는 6 참조). 이전에, 신속한 항우울제가 효과적인 대사성 수용체인 GABAB(감마아미노부티르산 서브타입 B)의 활성화를 필요로 한다는 것이 입증되었다(13). 또한, 이전의 데이터는 신속한 항우울제...

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DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn은 근접 결찰 분석 기술을 활용하여 시냅스의 변화를 신속하게 식별합니다. 우리는 또한 결과를 분석하기위한 프로토콜을 제공합니다. DetectSyn의 주요 장점은 분석 할 수있는 조직의 큰 영역에서 결과를 얼마나 빨리 얻을 수 있는지입니다.시작하려면 세포를 방해하지 않고 플라스틱 파스퇴르 피펫으로 블로킹 용액을 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 파라 필름으로 큰 플라스틱 페트리 접시를 줄 지어 라. 포셉을 사용하여 커버 슬립을 파라 필름으로 조심스럽게 옮깁니다.60 마이크로리터의 일차 항체 용액을 커버 슬립의 상부에 첨가하여, 항체 용액이 커버 슬립의 측면 위로 유출되지 않도록 한다. 습도를 제공하고 배양 중에 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 더 작은 페트리 접시에 초순수를 넣고 조심스럽게 덮개 슬립 주위에 접시를 놓습니다. 그런 다음 더 큰 페트리 디쉬를 덮고 배양된 세포를 실온에서 한 시간 동안 인큐베이션한다.일차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 포셉을 사용하여 커버 슬립에서 일차 항체 용액을 종이 타월 상에 조심스럽게 탭핑하고 커버 슬립을 500 마이크로리터의 PBS로 채워진 원래의 24-웰 플레이트로 옮긴다. 그 후 PBS로 샘플을 10분 동안 세 번 세척하고 오비탈 쉐이커 상에서 부드럽게 교반시킨다. 마지막 세척 후, 커버 슬립을 다시 큰 페트리 접시로 옮기고 40 마이크로 리터의 보조 항체 용액을 커버 슬립의 상단에 첨가하십시오.페트리 접시를 덮고 샘플을 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양하십시오. 라이게이션을 위해, 리가아제를 차가운 블록 상에 유지하면서, 라이게이션 스톡을 사용하여 리가아제 1 내지 40을 희석하고, 즉시 40 마이크로리터의 리가아제 믹스를 커버 슬립에 첨가한다. 페트리 접시를 덮고 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다.증폭을 위해, 증폭 스톡을 사용하여 차가운 블록 상에 중합효소(1280)를 희석한다. 이어서, 증폭 믹스 40 마이크로리터를 커버 슬립에 첨가하고, 샘플을 섭씨 37도에서 100분 동안 인큐베이션한다. 다음으로, 장착을 위해 세 마이크로리터의 장착 미디어를 슬라이드에 떨어뜨립니다.커버 슬립에서 과도한 세척 버퍼를 탭하고 셀이 아래쪽을 향하도록 커버 슬립을 장착 매체에 놓습니다. 덮개 슬립을 제자리에 고정하기 위해 소량의 투명한 매니큐어로 측면을 밀봉하십시오. 얇게 썬 조직을 장착하려면 조직 조각을 준비된 슬라이드로 조심스럽게 옮기고 평평하게 놓습니다.그런 다음 5 ~ 10 마이크로 리터의 장착 배지를 조직 슬라이스에 떨어 뜨립니다. 유리 커버 슬립을 티슈 슬라이스 위에 놓고 앞에서 설명한 것처럼 투명한 매니큐어로 커버 슬립을 밀봉하십시오. 공초점 현미경을 사용한 디지털 이미징의 경우 각 형광 채널의 게인, 오프셋 및 레이저 파워를 조정하여 배경 노이즈를 줄이고 형광 신호를 향상시킵니다.형광 신호가 과포화되지 않았는지 확인하십시오. 배양 뉴런의 경우 ND 획득 탭에서 파일에 저장을 클릭합니다. 그런 다음 찾아보기에서 이미지를 저장할 파일을 선택하고 파일 이름을 입력합니다.그런 다음 Z 탭에서 대칭 모드 범위로 정의 옵션을 선택합니다. 초점을 가장 좋은 맵 두 평면으로 설정하고 상대 버튼을 클릭하여 이 초점 평면을 Z-스택의 중간으로 설정합니다. 그런 다음 한 마이크로미터 스텝으로 범위를 다섯 마이크로미터로 설정하고 Z 이동 중에 활성 셔터 닫기를 확인합니다.파장 탭에서 광학 구성에서 이전에 구성된 수집 설정이 있는 광학 버튼의 이름을 선택하고 지금 실행을 클릭합니다. 슬라이스된 티슈의 경우 획득 메뉴에서 큰 이미지 스캔을 선택한 다음 캡처 패널 아래에서 이전에 구성된 획득 설정이 있는 광학 버튼을 선택합니다. 또한 이 패널에서 올바른 목표를 선택합니다.그런 다음 영역 패널과 아이피스 아래에서 화살표 키를 사용하여 관심 영역 또는 ROI의 경계를 설정합니다. 그런 다음 큰 이미지를 파일에 저장을 클릭하고 이미지의 저장 경로 파일 이름을 만듭니다. 마지막으로 설정 패널에서 다중 채널 캡처가 선택되어 있는지 확인합니다.그런 다음 광학 구성에서 이전에 구성된 수집 설정이 있는 광학 단추의 이름을 선택합니다. ImageJ에서 이미지 메뉴로 이동하여 조정을 클릭한 다음 임계값을 클릭하여 임계값 옵션을 엽니다. 이미지에 어두운 배경이 있는 경우 어두운 배경 옵션을 선택합니다.그런 다음 이전에 결정된 최적화된 임계값 설정당 임계값의 상한과 하한을 조정하고 적용을 클릭합니다. 배양된 세포의 경우 MAP2 채널과 자유 ROI 도구를 사용하여 수상 돌기 및 소마를 포함한 각 뉴런에 대한 ROI를 그립니다. 슬라이스된 조직의 경우 관심 영역을 캡슐화하는 슬라이스 이미지 내에 자유 손 ROI를 그립니다.그런 다음 분석 메뉴를 열고 측정을 클릭하여 ROI 영역을 가져옵니다. 각 ROI 내에서 펀타 수를 감지하려면 입자 분석과 같은 자동 감지 도구를 사용하십시오. 분석됨 메뉴에서 분석된 입자를 선택하고 누점 크기 지름을 정의합니다.그런 다음 표시 드롭 다운 메뉴에서 오버레이 마스크 옵션을 선택한 다음 결과 표시 옵션을 선택하고 확인을 클릭하십시오. 펀타 수를 개별 ROI의 영역으로 나누려면 스프레드시트에 팝업된 결과에서 각 이미지의 결과를 복사하여 붙여 넣습니다. 어떤 파일에서 얻은 데이터를 식별하고 샘플링하고 ROI 영역을 펀타 수로 나눕니다.마지막으로, 대조군 샘플에 대한 결과를 정규화하기 위해, 대조군 샘플에 대한 결과를 평균화하고, 모든 샘플의 수득된 결과를 대조군의 평균으로 나눈다. GABAB 작용제인 바클로펜은 신속한 항우울제 Ro-256981의 시험관내 효능을 위해 요구된다. 시냅스 형성의 증가는 흰 펀타의 증가에 의해 입증됩니다.바클로펜이 없으면 시냅스 형성의 증가가 보이지 않습니다. 생체내에서, 신속한 항우울제의 복강내 주사는 식염수 대조군에 비해 시냅스 형성의 증가를 초래한다. 일부 펀타는 기술 제어 이미지에 나타나지만 일반적으로 다른 패널의 큰 펀타와 비교하여 흰색 사양으로 입증 된 것과 동일한 크기가 아닙니다.또한,이 펀타는 소마 내에서 나타나는 일부 펀타에 의해 입증 된 것과 같은 위치에 있지 않습니다. DetectSyn은 질병 상태 또는 약물 치료로 인한 시냅스의 변화를 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 시냅스의 발달 또는 분해에 영향을 미치는 장애를 연구하는 모든 연구 분야에 대한 통찰력을 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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연구

생화학

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