Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) og NS105005-03S1 (KRG), Forsvarsdepartementet USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), og et stipend fra FRAXA Research (CFH) og Alzheimers Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Isolering av celler og vev fra dyr var i samsvar med National Institutes of Health's Guide for care and use of Laboratory Animals og godkjent av Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
MERK: Denne protokollen brukes på prøver som allerede er behandlet og fikset i henhold til spesifikke eksperimentelle paradigmer og krav. For demonstrasjonsformål brukes synapsedannelse på grunn av rask antidepressiv behandling til å markere denne synapsedeteksjonsteknikken...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn er en rask analyse som bruker en nærhet ligation analyse for å oppdage proteiner innen 40 nm av hverandre, noe som gjør det mulig å oppdage synapsedannelse. Denne teknikken forbedrer dagens fluorescerende analyser, som bare fungerer som proxy-målinger for synapsedannelse. DetectSyn oppdager kvantifiserbare endringer i synaptiske proteiner lokalisert innen 40 nm, det vil si innenfor synaptisk kløft, av hverandre. Videre er DetectSyn mer kostnadseffektivt og tar mindre tid enn teknikker, som elektronmikrosk...

Synapser er den grunnleggende kommunikasjonsenheten mellom nevroner1. Mange synapser mellom nevroner i de samme regionene gir opphav til kretser som formidler atferd2. Synapser består av en presynaptisk terminal fra en nevron som frigjør nevrotransmittere eller nevropeptider som videresender informasjon til postsynaptiske reseptorer av en annen nevron. Oppsummeringen av presynaptiske signaler bestemmer om den postsynaptiske nevronen vil avfyre et handlingspotensial og forplante meldingen til andre nevroner.
Synaptopatologi, nedbrudd av synapser, oppstår i sykdommer og lidelser preget av redusert nevralt volum, som Alzheimers sykdom og stor depressiv lidelse, noe som resulterer i kretser som ikke lenger optimalt utfører 3,4,5. Gjenoppretting av synapsetetthet ligger sannsynligvis til grunn for effekten av potensielle behandlinger for disse lidelsene. For eksempel ble det nylig demonstrert at økende synapser ligger til grunn for atferdseffekten av raske antidepressiva6. For raskt å screene mulige synaptopatologibehandlinger, krever forskere teknikker som raskt identifiserer endringer i synapsetall.
Nåværende metoder er enten tidkrevende og dyre (elektronmikroskopi, matrisetomografi), eller de undersøker bare postsynaptiske endringer uten å inkorporere presynaptisk engasjement (rygganalyser, immunfluorescens/colokalisering). Fargestoffer som DiI eller fluorescerende proteiner som GFP bidrar til å visualisere nevroner og karakterisere postsynaptiske spines. Ryggradsanalysen bruker imidlertid forskerdefinerte forhold for å bestemme morfologi, noe som kan redusere reproduserbarheten7. Videre blir det fortsatt avdekket hvordan de forskjellige ryggradsklassene forholder seg til funksjonelle synapser. Ryggradsdannelse kan være forbigående og kan reflektere postsynaptisk plastisitet, men disse ryggradene kan elimineres før de stabiliseres til en synapse med en presynaptisk nevron9.
Colocalization gir en bedre proxy for synapser enn ryggradsanalyse fordi man kan immunostain for presynaptiske og postsynaptiske proteiner. Synaptiske proteiner kan imidlertid gi lave colokaliseringsverdier fordi proteinene er sammenstilt og kanskje ikke overlapper konsekvent. Således, fordi proteinene ikke er helt overliggende, kan colokaliseringsteknikker ikke nøyaktig måle endringer i synapsedannelse på grunn av denne manglende informasjonen. Til slutt, selv om både elektronmikroskopi (EM) og matrisetomografi gir høyoppløselige bilder av synapser, er de tidkrevende. EM krever videre spesialisert utstyr, og forskere er begrenset til små mengder vev for et gitt eksperiment. Mens matrisetomografi elegant gir muligheten til å screene for mange proteiner på ultratynne seksjoner og kan kombineres med EM10, kan denne teknikken være for arbeidskrevende og utenfor omfanget av eksperimenter som må skannes raskt for endringer i synapsedannelse.
DetectSyn er en spesifikk anvendelse av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen muliggjør generell påvisning av proteinproteininteraksjoner. DetectSyn bridges proxy postsynaptiske tiltak ved å forsterke et fluorescerende signal som slippes ut av taggede pre- og postsynaptiske proteiner innen 40 nm fra hverandre. Hvis de synaptiske proteinene er innenfor 40 nm, som innenfor en synaptisk kløft, vil de sekundære antistoffene, som inneholder DNA-sonder, hybridisere til sirkulært DNA. Dette hybridiserte sirkulære DNA-et uttrykker en fluorescerende sonde, som deretter forsterkes og oppdages med standard fluorescerende mikroskopiteknikker (se figur 1). Avgjørende, i motsetning til EM og matrisetomografi, krever denne teknikken ikke spesialisert utstyr og tar omtrent samme tid som standard immunhiistokjemi. Tilgjengeligheten av denne teknikken gjør det dermed mulig for etterforskere utenfor forskningsintensive institusjoner å delta i synaptopatologiforskning. Videre kan denne teknikken undersøke endringer i synaptisk tetthet i flere hjerneregioner i et enkelt eksperiment, og tilbyr en mer helhetlig representasjon av synaptiske endringer på grunn av sykdom eller behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapser er stedet for kommunikasjon mellom nevroner. Nevronal kretsstyrke er relatert til synaptisk tetthet, og nedbrytningen av synapser er karakteristisk for sykdomstilstander som stor depressiv lidelse (MDD) og Alzheimers sykdom. Tradisjonelle teknikker for å undersøke synapsetall inkluderer genetisk uttrykk for fluorescerende markører (f.eks. grønt fluorescerende protein (GFP)), fargestoffer som fyller et nevron (f.eks. karbocyaninfarge, DiI) og immunfluorescerende deteksjon av ryggmarkører (f.eks. postsynaptisk tetthet 95 (PSD95)). En stor advarsel til disse proxy-teknikkene er at de bare identifiserer postsynaptiske endringer. Likevel er en synapse en forbindelse mellom en presynaptisk terminal og en postsynaptisk ryggrad. Gullstandarden for måling av synapsedannelse/eliminering krever tidkrevende elektronmikroskopi eller matrisetomografiteknikker. Disse teknikkene krever spesialisert opplæring og kostbart utstyr. Videre kan bare et begrenset antall nevroner vurderes og brukes til å representere endringer i en hel hjerneregion. DetectSyn er en rask fluorescerende teknikk som identifiserer endringer i synapsedannelse eller eliminering på grunn av en sykdomstilstand eller narkotikaaktivitet. DetectSyn benytter en rask nærhetsligasjonsanalyse for å oppdage sammenstilte pre- og postsynaptiske proteiner og standard fluorescerende mikroskopi, en teknikk som er lett tilgjengelig for de fleste laboratorier. Fluorescerende deteksjon av den resulterende puncta gir rask og objektiv analyse av eksperimenter. DetectSyn gir mer representative resultater enn elektronmikroskopi fordi større områder kan analyseres enn et begrenset antall fluorescerende nevroner. Videre fungerer DetectSyn for in vitro-dyrkede nevroner og faste vevsskiver. Til slutt er det gitt en metode for å analysere dataene som samles inn fra denne teknikken. Totalt sett tilbyr DetectSyn en prosedyre for å oppdage relative endringer i synapsetetthet på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander og er mer tilgjengelig enn tradisjonelle teknikker.

Data modifisert fra Heaney et al.6 presenteres for å demonstrere et eksperiment der økt synapsedannelse forventes (se6 for mer informasjon og en mer grundig diskusjon av mekanismen). Tidligere ble det demonstrert at raske antidepressiva krever aktivering av den hemmende metabotrope reseptoren, GABAB (gamma-aminosmørsyre subtype B), for å være effektiv13. Videre indikerte tidligere data at raske antidepressiva øker postsynaptiske markører<sup c...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn er en objektiv, rask fluorescerende analyse som måler endringer i relativ synapse (pre- og postsynaptisk engasjement) antall på tvers av behandlinger eller sykdomstilstander. Denne teknikken benytter en nærhet ligation teknikk som kan brukes både i dyrkede nevroner og fast vev.

DetectSyn: En rask, objektiv fluorescerende metode for å oppdage endringer i synapsetetthet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn drar nytte av nærhetsanalyseteknologien for raskt å identifisere endringer i synapser. Vi tilbyr også en protokoll for å analysere resultatene. Den største fordelen med DetectSyn er hvor raskt resultatene kan oppnås i de store vevsområdene som kan analyseres.Til å begynne med, fjern forsiktig blokkeringsløsningen med en pasteurpipette av plast uten å forstyrre cellene. Deretter linje en stor plast Petri parabolen med Parafilm. Og bruk tang, overfør forsiktig dekselslippene til Parafilm.Tilsett 60 mikroliter av den primære antistoffløsningen på toppen av dekselslippet, og sørg for at antistoffløsningen ikke søler over sidene av dekselslippet. For å gi fuktighet og forhindre at prøver tørker ut under inkubasjon, tilsett ultrarent vann til en mindre Petri-tallerken, og legg forsiktig parabolen rundt dekselslippene. Dekk deretter den større Petri-parabolen og inkuber de dyrkede cellene i en time ved romtemperatur.Etter inkubasjon med det primære antistoffet, bruk tang for å forsiktig trykke av den primære antistoffløsningen fra dekselet glir på et papirhåndkle og overfør dekselslippene til den opprinnelige 24-brønnsplaten fylt med 500 mikroliter PBS. Vask deretter prøvene med PBS tre ganger i 10 minutter hver med mild agitasjon på en orbital shaker. Etter den siste vasken, overfør dekselet glir tilbake til den store Petri-parabolen og tilsett 40 mikroliter av den sekundære antistoffløsningen til toppen av dekselslippet.Dekk Petri-parabolen og inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i en time. For ligation, mens du holder ligase på en kald blokk, fortynn ligase 1 til 40 ved hjelp av ligation lager og umiddelbart legge 40 mikroliters av ligase blanding til dekselet slips. Dekk Petri-parabolen og inkuber prøvene ved 37 grader Celsius i 30 minutter.For forsterkning, fortynn polymerasen 1280 på en kald blokk ved hjelp av forsterkningsmassen. Tilsett deretter 40 mikroliter av forsterkningsblandingen til dekselslippene og inkuber prøvene i 100 minutter ved 37 grader Celsius. Deretter slipper du tre mikroliter monteringsmedier på et lysbilde for montering.Trykk av overflødig vaskebuffer fra dekselslippet og plasser dekselslippet med celler vendt ned i monteringsmediet. Forsegle sidene med en liten mengde klar neglelakk for å holde dekselslippet på plass. For montering av skiver vev, overfør forsiktig en vevsskive til den forberedte lysbildet og legg den flatt.Slipp deretter 5 til 10 mikroliter monteringsmedier på vevsskiven. Legg et glassdeksel over vevsskiven og forsegle dekselslippet med klar neglelakk, som vist tidligere. For digital avbildning med et konfokalt mikroskop justerer du forsterkningen, forskyvningen og lasereffekten for hver fluorescerende kanal for å redusere bakgrunnsstøy og forbedre fluorescerende signal.Påse at lysstoffrørsignalet ikke er overmettet. For kulturnevronene, under ND Acquisition-fanen, klikker du på Lagre i fil. Velg deretter en fil under Bla gjennom for å lagre bildet og legge inn filnavnet.Velg deretter alternativet Symmetrisk modus definert etter område under Z-fanen. Sett fokus på det beste kartet to-plan og klikk på Relative knappen for å angi dette fokusplanet som midten av z-stabelen. Deretter setter du området til fem mikrometer med ett mikrometer trinn og merker av for Lukk aktiv lukker under Z-bevegelse.Under Wavelength-fanen velger du navnet på den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under Optisk konfigurasjon og klikker på Kjør nå. For skiver vev, velg Skann stort bilde på ervervmenyen, og velg deretter den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under opptakspanelet. Velg også riktig mål i dette panelet.Deretter bruker du piltastene under områdepanelet og øyestykket til å sette grensene for interesseområdet eller avkastningen. Klikk deretter på Lagre stort bilde til fil og opprett et lagre banefilnavn for bildet. Til slutt, under oppsettpanelet, må du sørge for at Multichannel Capture er merket.Velg deretter navnet på den optiske knappen med de tidligere konfigurerte anskaffelsesinnstillingene under optisk konfigurasjon. I ImageJ åpner du terskelalternativet ved å gå til bildemenyen, klikke på Juster og deretter Terskelverdi. Velg alternativet Mørk bakgrunn hvis bildet har en mørk bakgrunn.Deretter justerer du de øvre og nedre grensene for terskelen per tidligere bestemte optimaliserte terskelinnstillinger og klikker på Bruk. For dyrkede celler, bruk MAP2-kanalen og et gratis hånd-ROI-verktøy for å tegne en avkastning for hver nevron, inkludert dendritter og soma. For skiver vev, tegne en fri hånd avkastning i stykke bildet som innkapsler området av interesse.Deretter får du tak i roi-området ved å åpne Analyser-menyen og klikke på Mål. For å oppdage antall punta i hver avkastning, bruk et automatisk deteksjonsverktøy som partikkelanalyse. Velg Analyserte partikler på Analysert-menyen, og definer punktstørrelsesdiameteren.Deretter velger du alternativet Overleggsmasker på rullegardinmenyen vis, og deretter merker du av for Vis resultater og klikker på OK. Hvis du vil dele antall punta etter området for den enkelte avkastningen, kopierer og limer du inn resultatene for hvert bilde fra resultatene dukker opp i et regneark. Identifiser hvilken fil og ta prøver av dataene vi er hentet fra, og del området av avkastningen på antall punta.Til slutt, for å normalisere resultatene for å kontrollere prøver, gjennomsnitt resultatene for kontrollprøvene og dele de oppnådde resultatene av alle prøver med gjennomsnittet av kontrollen. GABAB-agonisten, baclofen, er nødvendig for in vitro-effekten av den raske antidepressive Ro-256981. En økning i synapsedannelse er demonstrert ved en økning i hvit punta.Uten baklofen ses ingen økning i synapseformasjonen. In vivo, intraperitoneal injeksjon av det raske antidepressive middelet resulterer i en økning i synapsedannelse sammenlignet med saltvannskontrollen. Mens noen punta vises i de tekniske kontrollbildene, er de generelt ikke av samme størrelse som demonstrert av den hvite spesifikasjonen sammenlignet med den store puntaen i de andre panelene.Videre er disse punta ikke på samme sted som demonstrert av noen punta som vises i soma. DetectSyn kan identifisere endringer i synapser på grunn av en sykdomstilstand eller narkotikabehandling. Denne metoden kan bidra til å gi innsikt til ethvert forskningsområde som studerer lidelsene som påvirker utviklingen eller nedbrytningen av synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Sondering Metode Forenkler Non-invasiv og berøringsfri Fastsettelse av Leaf termiske egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplex isotermiske forsterkning basert diagnostiske plattform for å oppdage Zika Chikungunya og Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En rotte Methyl-Seq plattform å identifisere Epigenetic endringer knyttet til Stress eksponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerende visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...