Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde NINDS R01 NS105005 (KRG) e NS105005-03S1 (KRG), Departamento de Defesa USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), e uma bolsa da FRAXA Research (CFH) e da Associação de Alzheimer, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

O isolamento de células e tecidos de animais foi de acordo com o Guia nacional de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório e aprovado pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais da Floresta de Despertar
NOTA: Este protocolo é utilizado em amostras já tratadas e fixas por paradigmas e requisitos experimentais específicos. Para fins de demonstração, a formação de sinapse devido ao tratamento antidepressivo rápido é usada para destacar esta técnica de detecção de sinapse...

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	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn é um ensaio rápido que usa um ensaio de ligadura de proximidade para detectar proteínas dentro de 40 nm uma da outra, o que permite a detecção da formação de sinapse. Esta técnica melhora os ensaios fluorescentes atuais, que servem apenas como medidas proxy para formação de sinapse. DetectSyn detecta alterações quantificáveis em proteínas sinápticas localizadas dentro de 40 nm, ou seja, dentro da fissura sináptica, umas das outras. Além disso, o DetectSyn é mais econômico e leva menos tempo d...

As sinapses são a unidade fundamental de comunicação entre os neurônios1. Muitas sinapses entre neurônios dentro das mesmas regiões dão origem a circuitos que mediam o comportamento2. As sinapses consistem em um terminal pré-sináptico de um neurônio que libera neurotransmissores ou neuropeptídeos que retransmitem informações para receptores postsináspicos de outro neurônio. A soma dos sinais pré-sinápticos determina se o neurônio postsinásptico disparará um potencial de ação e propagará a mensagem para outros neurônios.
A sinaptopatologia, a quebra das sinapses, surge em doenças e distúrbios marcados pela diminuição do volume neural, como a doença de Alzheimer e o transtorno depressivo grave, resultando em circuitos que não funcionam maisde forma ideal 3,4,5. Restaurar a densidade da sinapse provavelmente está por trás da eficácia de tratamentos potenciais para esses distúrbios. Por exemplo, foi recentemente demonstrado que o aumento das sinapses está por trás da eficácia comportamental dos antidepressivos rápidos6. Para testar rapidamente possíveis tratamentos de sinaptopatologia, os pesquisadores exigem técnicas que identifiquem rapidamente mudanças nos números da sinapse.
As metodologias atuais são demoradas e caras (microscopia eletrônica, tomografia de matriz), ou examinam apenas alterações postsináspticas sem incorporar engajamento pré-sináptico (análises da coluna vertebral, imunofluorescência/colocalização). Corantes como dii ou proteínas fluorescentes como gfp ajudam a visualizar neurônios e caracterizam espinhas pós-sinápticas. No entanto, a análise da coluna vertebral utiliza razões definidas pelo pesquisador para determinar a morfologia, o que pode diminuir a reprodutibilidade7. Além disso, como as diferentes classes de coluna vertebral se relacionam com sinapses funcionais ainda está sendo descoberto8. A formação da coluna vertebral pode ser transitória e pode refletir plasticidade post-sináptica, mas essas espinhas podem ser eliminadas antes de estabilizar em uma sinapse com um neurônio pré-sináptico9.
A colocalização fornece um proxy melhor para sinapses do que a análise da coluna vertebral, porque pode-se imunossuer proteínas pré-sinápticas e pós-sinápticas. No entanto, as proteínas sinápticas podem produzir baixos valores de colocalização porque as proteínas são justapostas e podem não se sobrepor consistentemente. Assim, como as proteínas não são totalmente sobrepostas, as técnicas de colocação podem não medir com precisão as alterações na formação de sinapse devido a essa informação perdida. Finalmente, embora tanto a microscopia eletrônica (EM) quanto a tomografia de matriz forneçam imagens de alta resolução de sinapses, elas são demoradas. A EM requer ainda equipamentos especializados, e os pesquisadores estão limitados a pequenos volumes de tecido para qualquer experimento. Embora a tomografia de array forneça elegantemente a capacidade de tela para muitas proteínas em seções ultrathin e possa ser combinada com o EM10, essa técnica pode ser muito trabalhosa e além do escopo de experimentos que precisam digitalizar rapidamente para mudanças na formação de sinapsia.
DetectSyn é uma aplicação específica do Ensaio de Ligadura de Proximidade duolink. O ensaio PLA permite a detecção geral de interações proteína-proteína. Detecta as pontes proxy medidas pós-sinápticas amplificando um sinal fluorescente emitido por proteínas pré e pós-sináptica marcadas dentro de 40 nm uma da outra. Se as proteínas sinápticas estiverem dentro de 40 nm, como dentro de uma fenda sináptica, então os anticorpos secundários, que contêm sondas de DNA, hibridizarão em DNA circular. Este DNA circular hibridizado expressa uma sonda fluorescente, que é então amplificada e detectada com técnicas padrão de microscopia fluorescente (ver Figura 1). Crucialmente, ao contrário da em e tomografia de matriz, esta técnica não requer equipamento especializado e leva cerca da mesma quantidade de tempo que a imunohistoquímica padrão. A acessibilidade dessa técnica, assim, permite que pesquisadores fora de instituições intensivas em pesquisa participem de pesquisas sinaptopológicas. Além disso, essa técnica pode examinar alterações na densidade sináptica em múltiplas regiões cerebrais dentro de um único experimento, oferecendo uma representação mais holística de mudanças sinápticas devido a doenças ou tratamento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Sinapses são o local de comunicação entre neurônios. A força do circuito neuronal está relacionada à densidade sináptica, e a quebra das sinapses é característica de estados da doença como transtorno depressivo grave (MDD) e doença de Alzheimer. Técnicas tradicionais para investigar números de sinapse incluem expressão genética de marcadores fluorescentes (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP)), corantes que preenchem um neurônio (por exemplo, corante de carbocianina, DI) e detecção imunofluorescente de marcadores de coluna (por exemplo, densidade pós-sináptica 95 (PSD95)). Uma grande ressalva a essas técnicas de proxy é que elas só identificam alterações postsináspticas. No entanto, uma sinapse é uma conexão entre um terminal pré-sináptico e uma coluna postsintáptica. O padrão-ouro para medir a formação/eliminação da sinapse requer técnicas demoradas de microscopia eletrônica ou tomografia de matriz. Essas técnicas exigem treinamento especializado e equipamentos caros. Além disso, apenas um número limitado de neurônios pode ser avaliado e são usados para representar alterações em toda uma região cerebral. DetectSyn é uma técnica fluorescente rápida que identifica alterações na formação ou eliminação da sinapse devido a um estado da doença ou atividade medicamentosa. DetectSyn utiliza um ensaio de ligadura de proximidade rápida para detectar proteínas pré e pós-sináptica justtaposed e microscopia fluorescente padrão, uma técnica prontamente disponível para a maioria dos laboratórios. A detecção fluorescente do puncta resultante permite uma análise rápida e imparcial dos experimentos. DetectSyn fornece resultados mais representativos do que microscopia eletrônica porque áreas maiores podem ser analisadas do que um número limitado de neurônios fluorescentes. Além disso, a DetectSyn trabalha para neurônios in vitro cultivados e fatias de tecido fixo. Finalmente, é fornecido um método para analisar os dados coletados dessa técnica. No geral, o DetectSyn oferece um procedimento para detectar alterações relativas na densidade de sinapse em tratamentos ou estados de doença e é mais acessível do que as técnicas tradicionais.

Os dados modificados de Heaney et al.6 são apresentados para demonstrar um experimento onde é esperada maior formação de sinapse (consulte6 para obter mais informações e uma discussão mais aprofundada do mecanismo). Anteriormente, foi demonstrado que antidepressivos rápidos requerem ativação do receptor metabotrópico inibidor, GABAB (subtipo B de ácido gama-aminobutírico), para ser eficaz13. Além disso, dados anteriores indicaram que an...

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DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn é um ensaio fluorescente rápido e imparcial que mede mudanças no número de sinapse relativa (engajamento pré e pós-sináptico) entre os estados de tratamento ou doença. Esta técnica utiliza uma técnica de ligadura de proximidade que pode ser usada tanto em neurônios cultivados quanto em tecido fixo.

DetectSyn: um método fluorescente rápido e imparcial para detectar alterações na densidade da sinapse

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn aproveita a tecnologia de ensaio de ligadura de proximidade para identificar rapidamente mudanças nas sinapses. Também fornecemos um protocolo para analisar os resultados. A principal vantagem do DetectSyn é a rapidez com que os resultados podem ser obtidos nas grandes regiões de tecido que podem ser analisadas.Para começar, remova cuidadosamente a solução de bloqueio com uma pipeta pasteur de plástico sem perturbar as células. Em seguida, forrar uma grande placa de petri de plástico com Parafilm. E usando fórceps, transfira cuidadosamente os deslizamentos de cobertura para o Parafilm.Adicione 60 microliters da solução de anticorpos primários à parte superior da tampa, garantindo que a solução de anticorpos não derrame sobre as laterais do deslizamento da tampa. Para fornecer umidade e evitar que as amostras sequem durante a incubação, adicione água ultrauso a uma placa de Petri menor e coloque cuidadosamente a placa ao redor dos deslizamentos de cobertura. Em seguida, cubra a placa de Petri maior e incuba as células cultivadas por uma hora à temperatura ambiente.Após a incubação com o anticorpo primário, use fórceps para cortar cuidadosamente a solução de anticorpos primários da tampa desliza para uma toalha de papel e transfira os deslizamentos de cobertura para sua placa original de 24 poços cheia com 500 microliters de PBS. Em seguida, lave as amostras com PBS três vezes por 10 minutos cada uma com agitação suave em um agitador orbital. Após a última lavagem, transfira a tampa desliza de volta para a grande placa de Petri e adicione 40 microliters da solução de anticorpos secundários ao topo da tampa.Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por uma hora. Para a ligadura, mantendo o ligase em um bloco frio, diluir o ligase de 1 a 40 usando o estoque de ligadura e adicionar imediatamente 40 microliters da mistura de ligase aos deslizamentos de cobertura. Cubra a placa de Petri e incuba as amostras a 37 graus Celsius por 30 minutos.Para amplificação, diluir a polimerase 1280 em um bloco frio usando o estoque de amplificação. Em seguida, adicione 40 microliters da mistura de amplificação aos deslizamentos de cobertura e incubar as amostras por 100 minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, para a montagem, solte três microliters de mídia de montagem em um slide.Toque no excesso de tampão de lavagem do deslizamento da tampa e coloque o deslizamento da tampa com as células voltadas para baixo na mídia de montagem. Sele os lados com uma pequena quantidade de esmalte transparente para manter o deslizamento da tampa no lugar. Para a montagem do tecido fatiado, transfira cuidadosamente uma fatia de tecido para o slide preparado e coloque-a plana.Em seguida, deixe cair de 5 a 10 microliters de mídia de montagem na fatia de tecido. Coloque uma tampa de vidro sobre a fatia de tecido e sele o deslizamento da tampa com esmalte claro, como demonstrado anteriormente. Para imagens digitais com um microscópio confocal, ajuste o ganho, deslocamento e poder laser para cada canal fluorescente para diminuir o ruído de fundo e melhorar o sinal fluorescente.Certifique-se de que o sinal fluorescente não está supersaturado. Para os neurônios da cultura, na guia ND Acquisition, clique em Salvar para Arquivo. Em seguida, em Procurar, escolha um arquivo para salvar a imagem e insira o nome do arquivo.Em seguida, na guia Z, selecione a opção Modo Simétrico Definido por Intervalo. Defina o foco para o melhor mapa de dois planos e clique no botão Relativo para definir este plano focal como o meio da pilha z. Em seguida, defina o intervalo para cinco micrômetros com um passo de micrômetro e verifique Fechar o obturador ativo durante o movimento Z.Na guia Comprimento de onda, selecione o nome do botão óptico com as configurações de aquisição configuradas anteriormente em Configuração Óptica e clique em Executar agora. Para tecido fatiado, a partir do menu de aquisição escolha Digitalizar grande imagem e, em seguida, sob o painel de captura, selecione o botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas. Além disso, selecione o objetivo correto neste painel.Em seguida, sob o painel de área e a peça ocular, use as teclas de seta para definir os limites da região de interesse ou ROI. Em seguida, clique em Salvar imagem grande para arquivar e criar um nome de arquivo save path para a imagem. Finalmente, no painel de configuração, certifique-se de que o Multichannel Capture seja verificado.Em seguida, escolha o nome do botão óptico com as configurações de aquisição previamente configuradas em configuração óptica. No ImageJ, abra a opção limiar indo para o menu de imagem, clicando em Ajustar e, em seguida, Limiar. Escolha a opção Fundo Escuro se a imagem tiver um fundo escuro.Em seguida, ajuste os limites superiores e inferiores do limiar por configurações de limiar otimizados previamente determinadas e clique em Aplicar. Para células cultivadas, use o canal MAP2 e uma ferramenta de ROI manual livre para desenhar um ROI para cada neurônio, incluindo dendritos e soma. Para o tecido fatiado, desenhe um ROI de mão livre dentro da imagem de fatia que encapsula a área de interesse.Em seguida, obtenha a área do ROI abrindo o menu Analisar e clicando em Medir. Para detectar o número de punta dentro de cada ROI, use uma ferramenta de detecção automática como análise de partículas. No menu Analisado, selecione Partículas Analisadas e defina o diâmetro do tamanho do puncta.Em seguida, a partir do menu suspenso do show, escolha a opção Máscaras sobrepostas, em seguida, verifique a opção Resultados de exibição e clique em Ok. Para dividir o número de punta pela área do ROI individual, copie e cole os resultados de cada imagem a partir dos resultados aparecem em uma planilha. Identifique de qual arquivo e amostra os dados de onde somos obtidos, e divida a área do ROI pelo número de punta.Por fim, para normalizar os resultados para controle das amostras, média dos resultados das amostras de controle e dividir os resultados obtidos de todas as amostras pela média do controle. O agonista GABAB, baclofen, é necessário para a eficácia in vitro do antidepressivo rápido Ro-256981. Um aumento na formação de sinapse é demonstrado por um aumento no punta branco.Sem baclofen, não se vê aumento na formação de sinapse. In vivo, a injeção intraperitoneal do antidepressivo rápido resulta em um aumento na formação de sinapse em comparação com o controle salino. Embora alguns punta apareçam nas imagens de controle técnico, eles geralmente não são do mesmo tamanho demonstrado pela especificação branca em comparação com o punta grande nos outros painéis.Além disso, esses punta não estão no mesmo local que demonstrado por algum punta que aparece dentro da soma. DetectSyn pode identificar alterações nas sinapses devido a um estado da doença ou tratamento medicamentoso. Este método pode ajudar a fornecer insights para qualquer área de pesquisa que estuda os transtornos que afetam o desenvolvimento ou a quebra de sinapses.

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