Name: detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density
Uploaded: 2022-07-22T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) och NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) och ett bidrag från FRAXA Research (CFH) och Alzheimer's Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).

Isolering av celler och vävnad från djur var i enlighet med National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals och godkänd av Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee
OBS: Detta protokoll används på prover som redan behandlats och fastställts enligt specifika experimentella paradigmer och krav. För demonstrationsändamål används synapsbildning på grund av snabb antidepressiv behandling för att markera denna synapsdetekteringsteknik<sup cl...

<ol>
	<li>S&#252;dhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+an+understanding+of+synapse+formation.">Towards an understanding of synapse formation.</a> Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).</li><li>Bliss, T. V., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synaptic+model+of+memory:+long-term+potentiation+in+the+hippocampus.">A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus.</a> Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).</li><li>Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+protein+synthesis+in+major+depressive+disorder.">Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder.</a> The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).</li><li>Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+remodeling+during+aging+and+in+Alzheimer's+disease.">Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 9, 91-99 (2006).</li><li>van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapse+pathology+in+psychiatric+and+neurologic+disease.">Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease.</a> Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).</li><li>Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+FMRP+in+rapid+antidepressant+effects+and+synapse+regulation.">Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation.</a> Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).</li><li>Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+shape+analysis-Classification+or+clusterization?+Perspective.">Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).</li><li>Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+and+physiological+plasticity+of+dendritic+spines.">Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines.</a> Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).</li><li>Berry, K. P., Nedivi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spine+Dynamics:+Are+they+all+the+same.">Spine Dynamics: Are they all the same.</a> Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).</li><li>Micheva, K. D., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Array+tomography:+A+new+tool+for+imaging+the+molecular+architecture+and+ultrastructure+of+neural+circuits.">Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits.</a> Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTORC1-dependent+protein+synthesis+underlying+rapid+antidepressant+effect+requires+GABABR+signaling.">mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling.</a> Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).</li><li>Li, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mTOR-dependent+synapse+formation+underlies+the+rapid+antidepressant+effects+of+NMDA+antagonists.">mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists.</a> Science. 329 (5994), 959-964 (2010).</li></ol>

DetectSyn är en snabb analys som använder en närhetsligeringsanalys för att detektera proteiner inom 40 nm från varandra, vilket möjliggör detektering av synapsbildning. Denna teknik förbättrar nuvarande fluorescerande analyser, som endast fungerar som proxymätningar för synapsbildning. DetectSyn detekterar kvantifierbara förändringar i synaptiska proteiner lokaliserade inom 40 nm, dvs inom den synaptiska klyftan, av varandra. Vidare är DetectSyn mer kostnadseffektivt och tar mindre tid än tekniker, som el...

Synapser är den grundläggande enheten för kommunikation mellan neuroner1. Många synapser mellan neuroner inom samma regioner ger upphov till kretsar som förmedlar beteende2. Synapser består av en presynaptisk terminal från en neuron som frigör neurotransmittorer eller neuropeptider som vidarebefordrar information till postsynaptiska receptorer hos en annan neuron. Summeringen av presynaptiska signaler avgör om den postsynaptiska neuronen kommer att avfyra en åtgärdspotential och sprida meddelandet till andra neuroner.
Synaptopatologi, nedbrytningen av synapser, uppstår i sjukdomar och störningar som kännetecknas av minskad neural volym, som Alzheimers sjukdom och egentlig depression, vilket resulterar i kretsar som inte längre optimalt utför 3,4,5. Att återställa synapstätheten ligger sannolikt till grund för effekten av potentiella behandlingar för dessa störningar. Till exempel visades det nyligen att ökande synapser ligger till grund för beteendeeffekten av snabba antidepressiva medel6. För att snabbt screena möjliga synaptopatologiska behandlingar kräver forskare tekniker som snabbt identifierar förändringar i synapsnummer.
Nuvarande metoder är antingen tidskrävande och dyra (elektronmikroskopi, arraytomografi), eller så undersöker de bara postsynaptiska förändringar utan att införliva presynaptiskt engagemang (ryggradsanalyser, immunofluorescens / kolokalisering). Färgämnen som DiI eller fluorescerande proteiner som GFP hjälper till att visualisera nervceller och karakterisera postsynaptiska ryggar. Ryggradsanalys använder dock forskardefinierade förhållanden för att bestämma morfologi, vilket kan minska reproducerbarheten7. Vidare avslöjas fortfarande hur de olika ryggradsklasserna relaterar till funktionella synapser8. Ryggradsbildning kan vara övergående och kan återspegla postsynaptisk plasticitet, men dessa ryggar kan elimineras innan de stabiliseras till en synaps med en presynaptisk neuron9.
Kolokalisering ger en bättre proxy för synapser än ryggradsanalys eftersom man kan immunfärga för presynaptiska och postsynaptiska proteiner. Synaptiska proteiner kan emellertid ge låga samlokaliseringsvärden eftersom proteinerna ligger bredvid varandra och kanske inte konsekvent överlappar varandra. Således, eftersom proteinerna inte är helt överlagrade, kan samlokaliseringstekniker inte exakt mäta förändringar i synapsbildning på grund av denna saknade information. Slutligen, även om både elektronmikroskopi (EM) och arraytomografi ger högupplösta bilder av synapser, är de tidskrävande. EM kräver vidare specialutrustning, och forskare är begränsade till små volymer vävnad för ett visst experiment. Medan arraytomografi elegant ger möjlighet att screena för många proteiner på ultratunna sektioner och kan kombineras med EM10, kan denna teknik vara för arbetsintensiv och utanför ramen för experiment som snabbt måste skanna efter förändringar i synapsbildning.
DetectSyn är en specifik tillämpning av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen möjliggör allmän detektion av protein-proteininteraktioner. DetectSyn överbryggar proxy postsynaptiska åtgärder genom att förstärka en fluorescerande signal som emitteras av taggade pre- och postsynaptiska proteiner inom 40 nm från varandra. Om de synaptiska proteinerna ligger inom 40 nm, som i en synaptisk klyfta, kommer de sekundära antikropparna, som innehåller DNA-sonder, att hybridiseras till cirkulärt DNA. Detta hybridiserade cirkulära DNA uttrycker en fluorescerande sond, som sedan förstärks och detekteras med standard fluorescerande mikroskopitekniker (se figur 1). Avgörande, till skillnad från EM och arraytomografi, kräver denna teknik inte specialutrustning och tar ungefär lika lång tid som standardimmunhistokemi. Tillgängligheten av denna teknik gör det således möjligt för utredare utanför forskningsintensiva institutioner att delta i synaptopatologisk forskning. Vidare kan denna teknik undersöka förändringar i synaptisk densitet i flera hjärnregioner inom ett enda experiment, vilket ger en mer holistisk representation av synaptiska förändringar på grund av sjukdom eller behandling.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP39920</td>
			<td>PBS made in house works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012929</td>
			<td>For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-MAP2 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab5392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear nail polish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1849418</td>
			<td>Other clear nail polish works, as well.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13131012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td>HP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal or fluorescent microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R HD25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken FITC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA1-72000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Mouse PLUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink donkey anti-Rabbit MINUS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Detection Reagents Far Red</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO92013</td>
			<td>Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DUO82049</td>
			<td>Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped paintbrush</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9691026</td>
			<td>Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12545MP</td>
			<td>Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1255015</td>
			<td>For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer, -20&#176;C</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76449-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>125480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td>e.g. NIS Elements, ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-015-2633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large petri dish, 100mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP24701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-Synapsin1 antibody</td>
			<td>Synaptic Systems</td>
			<td>106-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-106-1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-388-100</td>
			<td>Working volumes range from 3 &#181;L to 500 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pasteur pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-708-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision tweezers/foreceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-PSD95 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18258</td>
			<td>Other antibody pairs may work, as well, with optimization.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76470-402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small petri dish, 60 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-649-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detectsyn: a rapid, unbiased fluorescent method to detect changes in synapse density

Synapser är platsen för kommunikation mellan neuroner. Neuronal kretsstyrka är relaterad till synaptisk densitet, och nedbrytningen av synapser är karakteristisk för sjukdomstillstånd som egentlig depression (MDD) och Alzheimers sjukdom. Traditionella tekniker för att undersöka synapsnummer inkluderar genetiskt uttryck av fluorescerande markörer (t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP)), färgämnen som fyller en neuron (t.ex. karbocyaninfärgämne, DiI) och immunofluorescerande detektion av ryggradsmarkörer (t.ex. postsynaptisk densitet 95 (PSD95)). En viktig varning för dessa proxytekniker är att de bara identifierar postsynaptiska förändringar. Ändå är en synaps en koppling mellan en presynaptisk terminal och en postsynaptisk ryggrad. Guldstandarden för mätning av synapsbildning/eliminering kräver tidskrävande elektronmikroskopi eller arraytomografitekniker. Dessa tekniker kräver specialutbildning och kostsam utrustning. Vidare kan endast ett begränsat antal nervceller bedömas och används för att representera förändringar i en hel hjärnregion. DetectSyn är en snabb fluorescerande teknik som identifierar förändringar i synapsbildning eller eliminering på grund av ett sjukdomstillstånd eller läkemedelsaktivitet. DetectSyn använder en snabb närhetsligeringsanalys för att upptäcka bredvid varandra pre- och postsynaptiska proteiner och standard fluorescerande mikroskopi, en teknik som är lätt tillgänglig för de flesta laboratorier. Fluorescerande detektion av den resulterande puncta möjliggör snabb och opartisk analys av experiment. DetectSyn ger mer representativa resultat än elektronmikroskopi eftersom större områden kan analyseras än ett begränsat antal fluorescerande nervceller. Dessutom fungerar DetectSyn för in vitro-odlade nervceller och fasta vävnadsskivor. Slutligen tillhandahålls en metod för att analysera data som samlats in från denna teknik. Sammantaget erbjuder DetectSyn ett förfarande för att upptäcka relativa förändringar i synapstäthet över behandlingar eller sjukdomstillstånd och är mer tillgängligt än traditionella tekniker.

Data modifierade från Heaney et al.6 presenteras för att demonstrera ett experiment där ökad synapsbildning förväntas (se6 för mer information och en mer djupgående diskussion om mekanismen). Tidigare har det visats att snabba antidepressiva medel kräver aktivering av den hämmande metabotropa receptorn, GABAB (gamma-aminosmörsyra subtyp B), för att vara effektiv13. Vidare indikerade tidigare data att snabba antidepressiva medel ökar post...

Watch this Scientific Journal Video about DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density at JoVE.com

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn är en opartisk, snabb fluorescerande analys som mäter förändringar i relativt synapsantal (pre- och postsynaptiskt engagemang) över behandlingar eller sjukdomstillstånd. Denna teknik använder en närhetsligeringsteknik som kan användas både i odlade neuroner och fast vävnad.

DetectSyn: En snabb, opartisk fluorescerande metod för att upptäcka förändringar i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

DetectSyn utnyttjar analystekniken för närhetsligering för att snabbt identifiera ändringar i synapser. Vi tillhandahåller också ett protokoll för att analysera resultaten. Den största fördelen med DetectSyn är hur snabbt resultaten kan erhållas i de stora regionerna av vävnad som kan analyseras.Börja med att försiktigt ta bort blockeringslösningen med en Pasteur-pipett av plast utan att störa cellerna. Klä sedan en stor petriskål i plast med Parafilm. Och använd pincett, överför försiktigt täckslipsarna till Parafilmen.Tillsätt 60 mikroliter av den primära antikroppslösningen till toppen av täckslipen, så att antikroppslösningen inte spills över sidorna av täckglidningen. För att ge fuktighet och förhindra att prover torkar ut under inkubation, tillsätt ultrarent vatten till en mindre petriskål och placera försiktigt skålen runt täckslipsarna. Täck sedan den större petriskålen och inkubera de odlade cellerna i en timme vid rumstemperatur.Efter inkubation med den primära antikroppen, använd pincett för att försiktigt knacka av den primära antikroppslösningen från täcket på en pappershandduk och överför täckslipsarna till deras ursprungliga 24-brunnsplatta fylld med 500 mikroliter PBS. Tvätta sedan proverna med PBS tre gånger i 10 minuter vardera med mild omrörning på en orbitalskakare. Efter den sista tvätten, överför locket glider tillbaka till den stora petriskålen och tillsätt 40 mikroliter av den sekundära antikroppslösningen till toppen av täckglidningen.Täck petriskålen och inkubera proverna vid 37 grader Celsius i en timme. För ligering, medan du håller ligasen på ett kallt block, späd ligasen 1 till 40 med hjälp av ligeringsbeståndet och tillsätt omedelbart 40 mikroliter av ligasblandningen till täckglidningarna. Täck petriskålen och inkubera proverna vid 37 grader Celsius i 30 minuter.För förstärkning, späd polymeraset 1280 på ett kallt block med användning av förstärkningsbeståndet. Tillsätt sedan 40 mikroliter av förstärkningsblandningen till täckslipsarna och inkubera proverna i 100 minuter vid 37 grader Celsius. Därefter, för montering, släpp tre mikroliter av monteringsmedia på en bild.Knacka bort överflödig tvättbuffert från locket och placera locket med celler nedåt i monteringsmediet. Försegla sidorna med en liten mängd klart nagellack för att hålla täckglidningen på plats. För montering av skivad vävnad, överför försiktigt en vävnadsskiva till den förberedda bilden och lägg den platt.Släpp sedan 5 till 10 mikroliter monteringsmedia på vävnadsskivan. Placera ett glasskydd över vävnadsskivan och försegla täckglidningen med klart nagellack, som visat tidigare. För digital avbildning med ett konfokalmikroskop, justera förstärkning, förskjutning och lasereffekt för varje fluorescerande kanal för att minska bakgrundsbrus och förbättra lysrörssignalen.Se till att den fluorescerande signalen inte är övermättad. För odlingsneuronerna, under fliken ND Acquisition, klicka på Spara till fil. Välj sedan en fil för att spara bilden under Bläddra och mata in filnamnet.Välj sedan alternativet Symmetriskt läge definierat av intervall under fliken Z. Ställ in fokus på den bästa kartan två plan och klicka på relativ knapp för att ställa in detta fokalplan som mitten av z-stacken. Ställ sedan in intervallet på fem mikrometer med en mikrometer steg och kontrollera Stäng aktiv slutare under Z-rörelse.Under fliken Våglängd väljer du namnet på den optiska knappen med de tidigare konfigurerade förvärvsinställningarna under Optisk konfiguration och klickar på Kör nu. För skivad vävnad väljer du Skanna stor bild från hämtningsmenyn och väljer sedan den optiska knappen med de tidigare konfigurerade förvärvsinställningarna under hämtningspanelen. Välj också rätt mål i den här panelen.Använd sedan piltangenterna under områdespanelen och ögonstycket för att ställa in gränserna för intresseområdet eller avkastningen. Klicka sedan på Spara stor bild till fil och skapa ett spara sökvägsfilnamn för bilden. Slutligen, under inställningspanelen, se till att Multichannel Capture är markerat.Välj sedan namnet på den optiska knappen med de tidigare konfigurerade förvärvsinställningarna under optisk konfiguration. I ImageJ öppnar du tröskelalternativet genom att gå till bildmenyn, klicka på Justera och sedan Tröskel. Välj den Mörk bakgrund alternativ om bilden har en mörk bakgrund.Justera sedan de övre och nedre gränserna för tröskeln per tidigare fastställda optimerade tröskelinställningar och klicka på Apply. För odlade celler, använd MAP2-kanalen och ett roi-verktyg med fri hand för att rita en ROI för varje neuron, inklusive dendriter och soma. För skivad vävnad ritar du en avkastning på fri hand i segmentbilden som kapslar in intresseområdet.Få sedan roi-området genom att öppna menyn Analysera och klicka på Mät. För att upptäcka antalet punta inom varje ROI, använd ett automatiskt detektionsverktyg som partikelanalys. På menyn Analyserad väljer du Analyserade partiklar och definierar punctastorleksdiametern.Välj sedan alternativet Överläggsmasker från rullgardinsmenyn Visa, kontrollera sedan Alternativet Visa resultat och klicka på Okej. För att dela upp antalet punta med området för den enskilda AVKASTNINGEN, kopiera och klistra in resultaten för varje bild från resultaten som dyker upp i ett kalkylblad. Identifiera vilken fil och prova data vi får från och dela upp roi-området med antalet punta.Slutligen, för att normalisera resultaten för att kontrollera prover, genomsnitta resultaten för kontrollproverna och dela de erhållna resultaten för alla prover med genomsnittet av kontrollen. GABAB-agonisten, baklofen, krävs för in vitro-effekten av det snabba antidepressiva läkemedlet Ro-256981. En ökning av synapsbildning demonstreras av en ökning av vit punta.Utan baklofen ses ingen ökning av synapsbildning. In vivo resulterar intraperitoneal injektion av det snabba antidepressiva läkemedlet i en ökning av synapsbildning jämfört med saltlösningskontrollen. Medan vissa punta visas i de tekniska kontrollbilderna, är de i allmänhet inte samma storlek som demonstreras av den vita specifikationen jämfört med den stora punta i de andra panelerna.Vidare är dessa punta inte på samma plats som visas av vissa punta som förekommer inom soma. DetectSyn kan identifiera förändringar i synapser på grund av ett sjukdomstillstånd eller läkemedelsbehandling. Denna metod kan hjälpa till att ge insikt i alla forskningsområden som studerar störningar som påverkar utvecklingen eller nedbrytningen av synapser.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Probing metod Underlättar Icke-invasiv och beröringsfri bestämning av Leaf Termiska egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Multiplexed Isothermal Amplification Based Diagnostic Platform to Detect Zika, Chikungunya, and Dengue 1

Multiplexade isotermiska förstärkning baserat diagnostiska plattform för att upptäcka Zika, Chikungunya och Dengue 1

Zika, dengue, and chikungunya viruses are transmitted by mosquitoes, causing diseases with similar patient symptoms. However, they have different ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

En råtta metyl-Seq plattform att identifiera epigenetiska förändringar i samband med Stress exponering

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Fluorescerande visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamidgeler via en Efterfärgnings metod

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification

Cellfraktionering av U937-celler genom isopycnic density gradient reification

This protocol describes a method to obtain subcellular protein fractions from mammalian cells using a combination of detergents, mechanical lysis, and ...