Name: drosophila melanogaster larva injection protocol
Uploaded: 2021-10-19T14:45:00
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Ringraziamo i membri del Dipartimento di Scienze Biologiche della George Washington University (GWU) per la lettura critica del manoscritto. GT è stato supportato attraverso una borsa di studio estiva Harlan da GWU. Tutte le figure grafiche sono state realizzate utilizzando BioRender.

1. Allevamento di mosche
NOTA: Il ciclo di vita di D. melanogaster è diviso in quattro fasi: embrione, larva, pupa e adulto. Il tempo di generazione con condizioni di allevamento ottimali in laboratorio (~ 25 ° C, 60% di umidità e cibo sufficiente) è di circa 10 giorni dall'uovo fecondato all'adulto echiuso. Le femmine depongono circa 100 embrioni al giorno e l'embriogenesi dura circa 24 ore su 22. Le larve subiscono tre fasi di sviluppo (ins...

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	<li>Takehana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+a+pattern-recognition+receptor,+peptidoglycan-recognition+protein-LE,+activates+imd/relish-mediated+antibacterial+defense+and+the+prophenoloxidase+cascade+in+Drosophila+larvae.">Overexpression of a pattern-recognition receptor, peptidoglycan-recognition protein-LE, activates imd/relish-mediated antibacterial defense and the prophenoloxidase cascade in Drosophila larvae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (21), 13705-13710 (2002).</li><li>Senger, K., Harris, K., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GATA+factors+participate+in+tissue-specific+immune+responses+in+Drosophila+larvae.">GATA factors participate in tissue-specific immune responses in Drosophila larvae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (43), 15957-15962 (2006).</li><li>Kenmoku, H., Hori, A., Kuraishi, T., Kurata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mode+of+induction+of+the+humoral+innate+immune+response+in+Drosophila+larvae.">A novel mode of induction of the humoral innate immune response in Drosophila larvae.</a> Disease Models &amp; Mech.anisms. 10, 271-281 (2017).</li><li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterorhabditis+bacteriophora+excreted-secreted+products+enable+infection+by+Photorhabdus+luminescens+through+suppression+of+the+Imd+pathway.">Heterorhabditis bacteriophora excreted-secreted products enable infection by Photorhabdus luminescens through suppression of the Imd pathway.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2372 (2019).</li><li>Cherry, S., Silverman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+Drosophila:+New+tricks+from+an+old+friend.">Host-pathogen interactions in Drosophila: New tricks from an old friend.</a> Nature Immunology. 7 (9), 911-917 (2006).</li><li>Younes, S., Al-Sulaiti, A., Nasser, E., Najjar, H., Kamareddine, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+organism+in+host-pathogen+interaction+studies.">Drosophila as a model organism in host-pathogen interaction studies.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 214 (2020).</li><li>Kenney, E., Hawdon, J. M., O'Halloran, D. M., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secreted+virulence+factors+from+Heterorhabditis+bacteriophora+highlight+its+utility+as+a+model+parasite+among+Clade+V+nematodes.">Secreted virulence factors from Heterorhabditis bacteriophora highlight its utility as a model parasite among Clade V nematodes.</a> International Journal for Parasitology. 51 (5), 321-325 (2021).</li><li>Castillo, J. C., Reynolds, S. E., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immune+responses+to+nematode+parasites.">Insect immune responses to nematode parasites.</a> Trends in Parasitology. 27 (12), 537-547 (2011).</li><li>Leit&#227;o, A. B., Bian, X., Day, J. P., Pitton, S., Demir, E., Jiggins, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+effects+on+cellular+and+humoral+immune+responses+underlie+genotype-by-genotype+interactions+between+Drosophila+and+parasitoids.">Independent effects on cellular and humoral immune responses underlie genotype-by-genotype interactions between Drosophila and parasitoids.</a> PLoS Pathogens. 15 (10), 1008084 (2019).</li><li>Ramroop, J. R., Heavner, M. E., Razzak, Z. H., Govind, S. 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M., Link, N., Yamamoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+infectious+diseases.">Drosophila as a model for infectious diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2724 (2017).</li><li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annual Reviews of Immunology. 25, 697-743 (2007).</li><li>Garriga, A., Mastore, M., Morton, A., Pino, F. G., Brivio, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+of+Drosophila+suzukii+larvae+to+infection+with+the+nematobacterial+complex+Steinernema+carpocapsae-Xenorhabdus+nematophila.">Immune response of Drosophila suzukii larvae to infection with the nematobacterial complex Steinernema carpocapsae-Xenorhabdus nematophila.</a> Insects. 11 (4), 210 (2020).</li><li>Trienens, M., Kraaijeveld, K., Wertheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defensive+repertoire+of+Drosophila+larvae+in+response+to+toxic+fungi.">Defensive repertoire of Drosophila larvae in response to toxic fungi.</a> Molecular Ecology. 26 (19), 5043-5057 (2017).</li><li>Tafesh-Edwards, G., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+immunity+against+natural+and+nonnatural+viral+pathogens.">Drosophila immunity against natural and nonnatural viral pathogens.</a> Virology. 540, 165-171 (2020).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster.">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Seminars in Immunology. 27 (6), 357-368 (2015).</li><li>Dudzic, J. P., Kondo, S., Ueda, R., Bergman, C. 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J., Rezai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+microinjection+of+intact+Drosophila+melanogaster+larva+to+investigate+the+effect+of+serotonin+on+heart+rate.">Localized microinjection of intact Drosophila melanogaster larva to investigate the effect of serotonin on heart rate.</a> Lab on a Chip. 20 (2), 343-355 (2020).</li><li>Flatt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-history+evolution+and+the+genetics+of+fitness+components+in+Drosophila+melanogaster.">Life-history evolution and the genetics of fitness components in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 214 (1), 3-48 (2020).</li><li>Ciche, T. A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+RNAi+in+Heterorhabditis+bacteriophora:+a+nematode+insect+parasite+and+host+for+insect+pathogenic+symbionts.">Postembryonic RNAi in Heterorhabditis bacteriophora: a nematode insect parasite and host for insect pathogenic symbionts.</a> BMC Developmental Biology. 7, 101 (2007).</li><li>Joyce, S. A., Watson, R. J., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+pathogenicity+and+mutualism+in+Photorhabdus.">The regulation of pathogenicity and mutualism in Photorhabdus.</a> Current Opinion in Microbiology. 9 (2), 127-132 (2006).</li><li>Yang, G., Waterfield, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+TcdB+and+TccC+subunits+in+secretion+of+the+Photorhabdus+Tcd+toxin+complex.">The role of TcdB and TccC subunits in secretion of the Photorhabdus Tcd toxin complex.</a> PLoS Pathogens. 9 (10), 1003644 (2013).</li><li>Shokal, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+co-occurring+Wolbachia+and+Spiroplasma+endosymbionts+on+the+Drosophila+immune+response+against+insect+pathogenic+and+non-pathogenic+bacteria.">Effects of co-occurring Wolbachia and Spiroplasma endosymbionts on the Drosophila immune response against insect pathogenic and non-pathogenic bacteria.</a> BMC Microbiology. 16, 16 (2016).</li><li>Tomoyasu, Y., Denell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Larval+RNAi+in+Tribolium+(Coleoptera)+for+analyzing+adult+development.">Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development.</a> Development Genes and Evolution. 214 (11), 575-578 (2004).</li></ol>

Drosophila melanogaster è tra i modelli più preziosi e manipolati sperimentalmente utilizzati per le indagini sull'immunità innata e sulla patogenesi di varie infezioni microbiche. Ciò è dovuto al suo ciclo di vita semplice e veloce, alla semplice manutenzione in laboratorio, alla genetica evolutiva ben consolidata e alla diversa cassetta degli attrezzi genetica. I precedenti metodi di iniezioni di larve di D. melanogaster, come l'utilizzo di un dispositivo microfluidico ibrido o di un micromanipol...

Drosophila melanogaster è stata immensamente utilizzata nella ricerca biologica e biomedica per diversi decenni, poiché la sofisticata gamma di strumenti genetici e molecolari si è costantemente evoluta per l'analisi di una vasta gamma di studi1,2,3,4. Gli aspetti evolutivamente conservati dello sviluppo, dell'omeostasi e dell'immunità innata in D. melanogaster lo hanno reso un prezioso organismo modello per lo studio di varie malattie umane e degli insetti5,6. In particolare, il ruolo fondamentale del modello di D. melanogaster per lo studio dell'immunità è stato ampiamente esemplificato negli studi sulle mosche adulte. Tuttavia, gli studi sulle larve di D. melanogaster hanno anche contribuito alle conoscenze attuali e hanno esplorato principalmente le risposte immunitarie cellulari, in particolare per le infezioni da vespe e nematodi che si verificano attraverso la cuticola degli insetti7,8,9,10. Le larve di Drosophila melanogaster possiedono tre diversi tipi di cellule del sangue, collettivamente chiamate emociti: plasmatociti, cellule cristalline e lamellociti11,12,13. Queste cellule possono montare una serie di risposte immunitarie quando le larve di D. melanogaster sono infettate da agenti patogeni come batteri, funghi, virus e parassiti14,15,16. Le risposte immunitarie cellulari includono l'inghiottimento diretto (fagocitosi) di piccole molecole o batteri, la melanizzazione, l'incapsulamento di agenti patogeni più grandi come le uova parassitoidi e la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e ossido nitrico sintasi (NOS)17,18,19.
Al contrario, sono stati pubblicati meno studi sull'uso del modello larvale D. melanogaster per analizzare le risposte immunitarie umorali. Ciò è dovuto principalmente all'applicazione di saggi di alimentazione per l'infezione orale delle larve di D. melanogaster e a diverse sfide associate alla microiniezione di larve, tra cui la manipolazione precisa delle larve e l'uso corretto del microaghi, specialmente durante la penetrazione20,21. Pertanto, la limitata conoscenza dell'infezione larvale e le difficoltà tecniche (cioè l'alta mortalità) hanno spesso reso difficile l'uso del modello larvale di D. melanogaster. Un modello larvale avrà il potenziale per identificare nuovi meccanismi molecolari che forniranno ulteriori approfondimenti sulle interazioni ospite-patogeno e sull'induzione di specifiche risposte immunitarie innate dell'ospite contro le infezioni patogene.
Qui viene descritto in dettaglio un protocollo semplice ed efficiente che può essere utilizzato per iniettare larve di D. melanogaster con vari agenti patogeni, come i batteri. In particolare, le larve di D. melanogaster sono utilizzate per iniezioni con il patogeno umano Photorhabdus asymbiotica e il batterio non patogeno Escherichia coli. Questo metodo può essere utilizzato per la manipolazione e l'analisi delle risposte immunitarie di D. melanogaster a varie infezioni microbiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fly Food B (Bloomington Recipe)</td>
			<td>LabExpress</td>
			<td>7001-NV</td>
			<td>Food B, in narrow vials, 100 vials/tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15, Mono Petri Dishes Fully Stackable</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-342</td>
			<td>Diameter 100 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 x 15, Mono Petri dishes Fully Stackable</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-092</td>
			<td>Diameter 60 x 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillaries</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53440-186</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grade 1 qualitative filter paper standard grade, circle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28450-150</td>
			<td>Diameter 150 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab culture Class II Type A2 Biosafety Safety Cabinet</td>
			<td>ESCO</td>
			<td>LA2-4A2-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1425-500</td>
			<td>LB agar miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1426-500</td>
			<td>LB broth miller powder 500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Alfa Aesar, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31911-A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject III Programmable Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>3-000-207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Drosophila Vials, Polystyrene</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles, hypodermic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89219-316</td>
			<td>22 G, 25 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Next Generation Micropipette Puller</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SU-P1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-732</td>
			<td>Buffer PBS tablets biotech grade 200tab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes - plastic, disposable</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76124-652</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila melanogaster larva injection protocol

L'uso di modelli non convenzionali per studiare l'immunità innata e la virulenza dei patogeni fornisce una valida alternativa ai modelli di mammiferi, che possono essere costosi e sollevare questioni etiche. I modelli non convenzionali sono notoriamente economici, facili da maneggiare e cultura e non occupano molto spazio. Sono geneticamente suscettibili e possiedono sequenze genomiche complete e il loro uso non presenta considerazioni etiche. Il moscerino della frutta Drosophila melanogaster, ad esempio, ha fornito grandi intuizioni su una varietà di comportamento, sviluppo, metabolismo e ricerca sull'immunità. Più specificamente, le mosche e le larve adulte di D. melanogaster possiedono diverse reazioni di difesa innate che sono condivise con gli animali vertebrati. I meccanismi che regolano le risposte immunitarie sono stati per lo più rivelati attraverso studi genetici e molecolari nel modello D. melanogaster . Qui viene fornita una nuova tecnica di iniezione larvale, che promuoverà ulteriormente le indagini sui processi immunitari innati nelle larve di D. melanogaster ed esplorerà la patogenesi di una vasta gamma di infezioni microbiche.

Se eseguite correttamente, le iniezioni di larve di D. melanogaster mostrano un effetto specifico del batterio. I dati di sopravvivenza sono stati raccolti in diversi punti temporali a seguito di infezioni da P. asymbiotica (ceppo ATCC43943), E. coli (ceppo K12) e PBS (Figura 4). Mentre le larve di D. melanogaster sono sensibili a P. asymbiotica, che compromette rapidamente la sopravvivenza, le larve iniettate con controlli E. coli o PBS ...

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Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.

Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva

The use of unconventional models to study innate immunity and pathogen virulence provides a valuable alternative to mammalian models, which can be costly ...

Questo protocollo affronta le difficoltà e le sfide con la microiniezione della larva descrivendo un metodo preciso che consentirà l'uso della larva di Drosophila melanogaster come modello per vari studi immunitari e molecolari. Questa è una semplice tecnica di iniezione che presenta un metodo efficiente, economico e rapido per fornire ripetutamente una varietà di sostanze in modo uniforme, il che consente risultati coerenti e affidabili. Inizia selezionando le larve del terzo stadio instar e lavandole con la soluzione di Ringer in una piccola capsula di Petri.Mettere una carta da filtro in una capsula di Petri e inumidirla con 5 ml di soluzione di Ringer. Quindi posizionare le larve sulla carta da filtro. Preparare i capillari utilizzando tubi capillari di vetro da 3,5 "in un estrattore di micropipette.Aprire il capillare di vetro con l'aiuto di pinze dritte a punto medio seghettato. Riempire il capillare aperto con olio minerale usando una siringa monouso di plastica. Quindi, espellere l'olio dal tubo capillare con un iniettore nanoliter.Riempire il capillare con la preparazione batterica desiderata per l'iniezione. Trasferire le larve anestetizzate su una carta da filtro inumidita con la soluzione di Ringer. Usando la pinza, applicare una forte pressione sul lato dorsale dell'estremità posteriore delle larve, dove sono evidenti gli spiracoli tracheali.Quindi, inserire l'ago orizzontalmente, verso l'estremità posteriore delle larve, e iniettare le scorte batteriche. Rimuovere la pinza per evitare fuoriuscite di emolinfa o intestino. Quindi, prelevare l'ago precedentemente inserito nelle larve.Infettare 20 larve per ogni condizione sperimentale. Usando un pennello, trasferire delicatamente le larve iniettate su una carta da filtro umida separata. Aggiungere la soluzione di Ringer se necessario per evitare l'essiccazione.Incubare la capsula di Petri in un'incubatrice a 25 C.Le larve di Drosophila melanogaster infettate da Photorhabdus asymbiotica hanno mostrato un tasso di sopravvivenza del 57% per 24 ore dopo l'iniezione, mentre la larva iniettata con Escherichia coli ha mostrato un tasso di sopravvivenza dell'85% nello stesso momento. L'importanza di questo metodo è che l'ago è tenuto approssimativamente parallelo alla larva. La pressione applicata per trattenere la larva è molto piccola, il che riduce la possibilità di perdite di emolinfa, lesioni mortali o consegna inadeguata della sostanza desiderata.Questa tecnica può essere perfezionata con la pratica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Induzione di lesioni polmonari del topo da Iniezione endotracheale di Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...