Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح NIH MH115939 و NS112121 و NS105640 و R56MH122449-01A1 (إلى أنتوني ج. كوليسكي) ومن مؤسسة العلوم الإسرائيلية (المنح رقم 1462/17 و 2142/21) (إلى هافا جيل هين).

تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) بجامعة بار إيلان.
ملاحظة: يظهر في الشكل 1 تصوير رسومي خطوة بخطوة للإجراء الموضح في هذا القسم.
1. زراعة الخلايا
م?...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

تعد ديناميكيات نتوء حافة الخلية ، التي تتكون من نتوءات وتراجعات وكشكشة ، شرطا أساسيا وحدثا محتملا يحد من المعدل في حركة الخلية. هنا نصف طريقة سريعة وبسيطة لقياس ديناميكيات نتوءات حافة الخلية أثناء الانتشار. تتيح هذه الطريقة التصوير لفترة قصيرة ، وتولد كمية كبيرة من البيانات ، ولا تتطلب وض...

هجرة الخلايا هي عملية حاسمة تتحكم في تطور ووظيفة جميع الكائنات الحية. تحدث هجرة الخلايا في كل من الحالات الفسيولوجية ، مثل التكوين الجنيني ، والتئام الجروح ، والاستجابة المناعية ، وفي الحالات المرضية ، مثل ورم خبيث سرطاني وأمراض المناعة الذاتية. على الرغم من الاختلافات في أنواع الخلايا التي تشارك في أحداث الهجرة المختلفة، فإن جميع أحداث حركية الخلايا تشترك في آليات جزيئية مماثلة، والتي تم حفظها في التطور من البروتوزوا إلى الثدييات، وتتضمن آليات مشتركة للتحكم في الهيكل الخلوي يمكنها استشعار البيئة، والاستجابة للإشارات، وتعديل سلوك الخلية استجابة لذلك1.
يمكن أن تكون المرحلة الأولية في هجرة الخلايا هي تكوين نتوءات ديناميكية للغاية في الحافة الأمامية للخلية. خلف الصفيحة يمكن للمرء أن يجد الصفيحة ، التي تزاوج بين الانقباض بوساطة الميوسين II وتتوسط الالتصاق بالركيزة الأساسية. يتم تحفيز Lamellipodia بواسطة محفزات خارج الخلية مثل عوامل النمو والسيتوكينات ومستقبلات التصاق الخلايا ويتم دفعها بواسطة بلمرة الأكتين ، والتي توفر القوة الفيزيائية التي تدفع غشاء البلازما إلى الأمام 2,3. وقد تورطت العديد من الإشارات والبروتينات الهيكلية في هذا. من بينها Rho GTPases ، التي تعمل بشكل منسق مع إشارات أخرى لتنشيط البروتينات المنظمة للأكتين مثل مركب Arp 2/3 ، وبروتينات عائلة WASP ، وأعضاء عائلات Formin و Spire في lamellipodia2,4,5.
بالإضافة إلى بلمرة الأكتين ، هناك حاجة إلى نشاط الميوسين II لتوليد قوى انقباضية في الصفيحة والصفائح الأمامية. هذه الانقباضات، التي تعرف أيضا بأنها تراجعات حافة الخلية، يمكن أن تنتج أيضا عن إزالة بلمرة الأكتين الشجيري في محيط الخلية، وهي ضرورية لتطوير الحافة الرائدة الصفائحية والسماح للنتوء باستشعار مرونة المصفوفة خارج الخلية والخلايا الأخرى وتحديد اتجاه الهجرة6،7،8 . ستشكل نتوءات حافة الخلية التي لا يمكن أن تلتصق بالركيزة كشكشة غشائية محيطية ، وهياكل تشبه الورقة تظهر على السطح البطني للصفيحة والصفائح وتتحرك إلى الوراء بالنسبة لاتجاه الهجرة. عندما يفشل الصفائحي في الالتصاق بالركيزة ، يتشكل صفيحة خلفية تحتها ويدفع ميكانيكيا الرقائقي الأول نحو السطح البطني العلوي. خيوط الأكتين في الكشكشة التي كانت موازية سابقا للركيزة أصبحت الآن عمودية عليها ، ويتم الآن وضع الكشكشة فوق الصفائح المتقدمة. الكشكشة التي تتحرك إلى الوراء تعود إلى السيتوسول وتمثل آلية خلوية لإعادة تدوير الأكتين الرقائقي9,10.
هنا ، نصف فحصا لقياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية. يستخدم فحص النتوء الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني لقياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية الواحدة لمدة 10 دقائق خلال مرحلة انتشار الخلية. يتم تحليل ديناميكيات النتوء عن طريق توليد kymographs من هذه الأفلام. من حيث المبدأ، يضفي الكيموغراف بيانات كمية مفصلة عن الجسيمات المتحركة في مخطط مكاني زماني لإنتاج فهم نوعي لديناميكيات حافة الخلية. يتم رسم شدة الجسيم المتحرك لجميع مكدسات الصور في مخطط زمني مقابل مكاني، حيث يمثل المحور X والمحور Y الوقت والمسافة، على التوالي11. تستخدم هذه الطريقة تحليل kymograph اليدوي مع ImageJ للحصول على بيانات كمية مفصلة ، مما يتيح استرداد المعلومات من الأفلام والصور في حالة انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء و / أو كثافة الميزات العالية ، وتحليل الصور التي تم الحصول عليها في المجهر الضوئي تباين الطور أو جودة الصورة الرديئة.
يعد فحص ديناميكيات نتوء حافة الخلية الموصوف هنا طريقة سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة. على هذا النحو ، ولأنه ثبت أنه يرتبط ارتباطا مباشرا بهجرة الخلايا 11,12 ، يمكن استخدامه كطريقة أولية لاختبار ديناميكيات الهيكل الخلوي المشاركة في حركة الخلية قبل اتخاذ قرار بإجراء طرق أكثر تطلبا للموارد. علاوة على ذلك ، فإنه يتيح أيضا القياس الكمي لكيفية تأثير التلاعب الجيني (الضربة القاضية أو الضربة القاضية أو هياكل الإنقاذ) للبروتينات الهيكلية الخلوية على ديناميكيات الهيكل الخلوي باستخدام منصة مباشرة. الفحص هو نموذج مفيد لاستكشاف ديناميكيات الهيكل الخلوي في سياق هجرة الخلايا ويمكن استخدامه لتوضيح الآليات والجزيئات الكامنة وراء حركة الخلية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

يعتمد تطوير وتوازن الكائنات الحية متعددة الخلايا على التنظيم المنسق لهجرة الخلايا. هجرة الخلايا هي حدث أساسي في بناء وتجديد الأنسجة ، وهي حاسمة في التطور الجنيني ، والاستجابات المناعية ، والتئام الجروح. يساهم خلل تنظيم حركة الخلايا في الاضطرابات المرضية ، مثل الالتهاب المزمن وورم خبيث سرطاني. تبدأ هجرة الخلايا وغزو الأنسجة والمحور العصبي ونمو التشعبات مع نتوءات حافة الخلية بوساطة بلمرة الأكتين. هنا ، نصف طريقة بسيطة وفعالة وموفرة للوقت للتصوير والتحليل الكمي لديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار. تقيس هذه الطريقة السمات المنفصلة لديناميكيات غشاء حافة الخلية، مثل النتوءات والتراجع والكشكشة، ويمكن استخدامها لتقييم كيفية تأثير التلاعب بمنظمات الأكتين الرئيسية على نتوءات حافة الخلية في سياقات متنوعة.

في التجربة الموصوفة في الشكل 2 ، تم طلاء MEFs المخلدة على أطباق ذات قاع زجاجي مغلفة مسبقا بالفيبرونيكتين لتنشيط الإشارات بوساطة integrin ، والتي تم حظرها بواسطة BSA المشوهة ، لمنع المواقع المحتملة الحرة للالتصاق الخلايا التي لا تعتمد على تنشيط integrin. للوصول إلى مرحلة النمو اللوغار...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

يهدف هذا البروتوكول إلى قياس المعلمات الديناميكية (النتوءات ، التراجع ، الكشكشة) للنتوءات على حافة الخلايا المنتشرة.

قياس ديناميكيات نتوء حافة الخلية أثناء الانتشار باستخدام المجهر الخلوي الحي

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

وقد تبين أن اختبار نتوء حافة الخلية يرتبط ارتباطا مباشرا بهجرة الخلايا. لذلك يمكن استخدامه كطريقة أولية لتحديد البروتينات الحرجة وآليات الإشارات المشاركة في حركة الخلية. هذه الطريقة سريعة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة ولا تتطلب وضع علامات على الفلورسنت أو استخدام مجهر فلورسنت باهظ الثمن.سيوضح الإجراء ميشال جيندلر ، وهو طالب من مختبري. أضف ملليلترين من محلول حمض الهيدروكلوريك العادي في وسط طبق زجاجي سفلي واحتضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الطبق ثلاث مرات بملليلتر من PBS.تمييع الفيبرونيكتين عند 10 ميكروغرام لكل تركيز ملليلتر في PBS وإضافة 200 ميكرولتر من المحلول المخفف إلى طبق المركز الزجاجي. تحضن لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. قم بإعداد حل BSA بنسبة 1٪ و PBS وتمريره عبر مرشح 0.2 ميكرومتر.قم بتشويه المحلول عن طريق الحضانة عند 70 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حمام مائي تم تسخينه مسبقا. اغسل الطبق السفلي الزجاجي المطلي بملليلترين من PBS ثلاث مرات. أضف ملليلترين من محلول BSA المشوه واحتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.اغسل الطبق الزجاجي بملليلترين من PBS ثلاث مرات. قبل 16 إلى 18 ساعة من التجربة على 0.7 مليون خلية لكل صفيحة زراعة الأنسجة التي يبلغ قطرها 10 سنتيمترات لتحقيق التقاء 70 إلى 80٪. في اليوم التالي ، أضف ملليلترين من محلول التربسين إلى لوحة زراعة الأنسجة واحتضنها لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتم فصل الخلايا.أضف خمسة ملليلترات من الوسط لتعطيل التربسين. باستخدام مقياس الدم ، عد الخلايا ولوحة 20،000 خلية في ملليلترين من الوسط الكامل في طبق سفلي. ثم احتضن الطبق بخلايا مطلية في حاضنة لمدة 15 دقيقة.قم بتشغيل وحدة التدفئة واضبطها على 37 درجة مئوية قبل ساعة واحدة من التصوير. أيضا ، قم بتشغيل وحدة ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 5٪ 10 دقائق قبل التصوير. قم بتشغيل المجهر والكاميرا.قم بتشغيل الكمبيوتر وافتح برنامج اقتناء المجهر. اضبط التكبير على تباين مرحلة العدسة الجافة 40X. اضبط إجمالي مدة الفيلم على 10 دقائق مع فاصل زمني مدته خمس ثوان.بعد 15 دقيقة من الحضانة ، ضع الطبق السفلي الزجاجي مع الخلايا الملتصقة في محول وقم بإصلاحه. أدخل المحول مع الطبق في الفتحات في مرحلة المجهر. اخلع غطاء الطبق ، وضع غطاء ثاني أكسيد الكربون وافتح صمام ثاني أكسيد الكربون.حدد موقع خلية مناسبة للتصوير. ابدأ الحصول على الفيلم بعد التركيز على الخلية. لإجراء تحليل الصورة، حدد الأداة المستقيمة في برنامج تحليل الصور واجعل ثمانية أسطر من 20 وحدة عشوائية عمودية على النتوءات في ترتيب شعاعي عند كل 45 درجة، بما في ذلك الصفيحة وحافة الخلية.في شريط الأدوات الرئيسي ، انتقل إلى الصورة ، وحدد Stacks ثم انقر فوق Reslice لإنشاء صورة kymograph تصف حركة النقاط المفردة داخل غشاء الخلية. باستخدام صور kymograph ، قم باستخراج عدد النتوءات والتراجع والكشكشة في كل منطقة من المناطق الثماني في الخلية المميزة بخطوط الشبكة وعدها يدويا. تمثل هذه الأرقام تواتر النتوءات والتراجع والكشكشة لكل 10 دقائق.تحديد ثبات النتوء والمسافة والسرعة عن طريق تحليل الكيموغرافيا. لتحديد مسافة النتوء ، ارسم خطا عموديا من قاعدة النتوء إلى أعلى قمة للنتوء. اضغط على M لقياس طول الخط بالبكسل والتأكد من أن نسبة البكسل إلى الميكرومتر معروفة بتحويل الطول بالميكرومتر.تم إجراء تحديد كمي للنتوءات والتفاعلات والكشكشة يدويا لكل 10 دقائق وكان متوسط التردد الذي تم الحصول عليه للنتوءات والتراجع 5.1 و 2.1 للكشكشة. كان للكيموجراف التمثيلي مسافة نتوء تبلغ حوالي 4.8 ميكرومتر ووقت نتوء يبلغ حوالي 0.6 دقيقة. يتم تمثيل مثال على خلية يجب استبعادها من التحليل.كشف تحليل الكيموغرافيا أن الخلية لم تكن موجودة في مرحلة انتشارها ولم تظهر أي نتوءات غشائية واضحة. الشيء الأكثر أهمية هو اختيار الخلايا الصحيحة للتصوير. يجب أن تكون الخلية المناسبة في مرحلة انتشارها ويجب ألا تلمس الخلايا الأخرى لتجنب الاتصال والإشارات بين الخلايا الخلوية.يمكن استخدام هذه الطريقة كأداة أولية لاختبار ديناميكيات الهيكل الخلوي التي تنطوي على حركة الخلية قبل اتخاذ قرار بإجراء المزيد من النتائج التي تتطلب فحوصات هجرة الخلايا.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

يعيش استجابة الخلية لتحفيز الميكانيكية المتكاملة التي درستها فرقة الميكروسكوب الضوئي والذرية

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

يعيش التصوير خلية من فأر الابتدائية حديثي الولادة العضلية بعد الغدانية وLentiviral تنبيغ طريق متحد البؤر المجهري القرص الغزل

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

يعيش التصوير خلية وتحليل 3D من أنجيوتنسين مستقبلات نوع 1A الاتجار في خلايا الكلى Transfected الجنينية البشرية عن طريق الميكروسكوب متحد البؤر

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

يعيش خلية Fluorescence مجهرية لمراقبة العمليات الأساسية أثناء نمو الخلايا الميكروبية

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

التحقيق "تضر الآثار من منخفضة الضغط البلازما التعقيم" على البقاء لجراثيم Bacillus نجحت "باستخدام خلية يعيش مجهرية"

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

مجهر القوة نتوء: أسلوب لتحديد حجم القوات المتقدمة بنتوءات الخلية

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

استغلال التصوير الحي إلى نويات المسار خلال ميوبلاست التمايز والانصهار

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...