Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH MH115939, NS112121, NS105640 en R56MH122449-01A1 (aan Anthony J. Koleske) en van de Israel Science Foundation (subsidies nummer 1462/17 en 2142/21) (aan Hava Gil-Henn).

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Bar-Ilan University.
OPMERKING: Een stapsgewijze grafische weergave van de procedure die in deze sectie wordt beschreven, wordt weergegeven in figuur 1.
1. Celkweek
OPMERKING: De cellen die in het protocol worden gebruikt, zijn embryonale fibroblasten van mui...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

Cel-edge uitsteekseldynamiek, bestaande uit uitsteeksels, retracties en ruches, is zowel een vereiste als een potentiële snelheidsbeperkende gebeurtenis in celmotiliteit. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het meten van de dynamiek van celranduitsteeksels tijdens het verspreiden. Deze methode maakt beeldvorming met een korte tijd mogelijk, genereert een aanzienlijke hoeveelheid gegevens, vereist geen fluorescerende etikettering van cellen of dure fluorescerende microscopieapparatuur en kan worden ...

Celmigratie is een kritisch proces dat de ontwikkeling en functie van alle levende organismen regelt. Celmigratie vindt plaats in zowel fysiologische omstandigheden, zoals embryogenese, wondgenezing en immuunrespons, als bij pathologische aandoeningen, zoals kankermetastase en auto-immuunziekte. Ondanks verschillen in celtypen die deelnemen aan verschillende migratiegebeurtenissen, delen alle celmotiliteitsgebeurtenissen vergelijkbare moleculaire mechanismen, die bewaard zijn gebleven in de evolutie van protozoa tot zoogdieren, en omvatten ze gemeenschappelijke cytoskeletale controlemechanismen die de omgeving kunnen detecteren, reageren op signalen en celgedrag in reactie kunnen moduleren1.
Een eerste fase in celmigratie kan de vorming van zeer dynamische uitsteeksels aan de voorrand van de cel zijn. Achter het lamellipodium bevindt zich de lamellen, die actine koppelt aan myosine II-gemedieerde contractiliteit en adhesie aan het onderliggende substraat bemiddelt. Lamellipodia worden geïnduceerd door extracellulaire stimuli zoals groeifactoren, cytokines en celadhesiereceptoren en worden aangedreven door actinepolymerisatie, die de fysieke kracht levert die het plasmamembraan naar voren duwt2,3. Veel signalerende en structurele eiwitten zijn hierbij betrokken; onder hen zijn Rho GTPases, die coördinerend werken met andere signalen om actine-regulerende eiwitten te activeren, zoals het Arp 2/3-complex, WASP-familie-eiwitten en leden van de Formin- en Spire-families in lamellipodia2,4,5.
Naast actinepolymerisatie is myosine II-activiteit vereist voor het genereren van contractiele krachten op het lamellipodium en de voorste lamellen. Deze samentrekkingen, ook gedefinieerd als celrandterugtrekkingen, kunnen ook het gevolg zijn van depolymerisatie van dendritische actine aan de celrand en zijn van cruciaal belang voor het ontwikkelen van de lamellipodiale voorrand en het uitsteeksel in staat stellen de flexibiliteit van de extracellulaire matrix en andere cellen te voelen en de migratierichting te bepalen6,7,8 . Uitsteeksels van de celrand die zich niet aan het substraat kunnen hechten, vormen perifere membraanruches, plaatachtige structuren die op het ventrale oppervlak van lamellipodia en lamellen verschijnen en achteruit bewegen ten opzichte van de migratierichting. Omdat het lamellipodium zich niet aan het substraat hecht, vormt zich eronder een achterste lamellipodium en duwt het eerste lamellipodium mechanisch naar het bovenste ventrale oppervlak. De actinefilamenten in de ruche die vroeger evenwijdig aan het substraat waren, komen er nu loodrecht op te staan en de ruche bevindt zich nu boven het oprukkende lamellipodium. De ruche die naar achteren beweegt, valt terug in het cytosol en vertegenwoordigt een cellulair mechanisme voor het recyclen van lamellipodiaal actine9,10.
Hier beschrijven we een test voor het meten van celrand uitsteekseldynamiek. De uitsteekseltest maakt gebruik van time-lapse videomicroscopie om gedurende 10 minuten tijdens de verspreidingsfase van de cel een enkele celrand uitsteekseldynamiek te meten. Uitsteekseldynamiek wordt geanalyseerd door kymografen uit deze films te genereren. In principe geeft een kymograaf gedetailleerde kwantitatieve gegevens van bewegende deeltjes in een spatiotemporale plot om een kwalitatief begrip van de celranddynamica te verkrijgen. De intensiteit van het bewegende deeltje wordt uitgezet voor alle beeldstapels in een tijd versus ruimte plot, waarbij de X-as en de Y-as respectievelijk tijd en afstand vertegenwoordigen11. Deze methode maakt gebruik van een handmatige kymograafanalyse met ImageJ om gedetailleerde kwantitatieve gegevens te verkrijgen, waardoor informatie uit films en afbeeldingen kan worden opgehaald in geval van een lage signaal-ruisverhouding en / of hoge functiedichtheid, en de analyse van afbeeldingen die zijn verkregen in fasecontrastlichtmicroscopie of slechte beeldkwaliteit.
De celrand uitsteekseldynamiektest die hierin wordt beschreven, is een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve methode. Als zodanig, en omdat is aangetoond dat het direct correleert met celmigratie11,12, kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het testen van cytoskeletale dynamica die betrokken is bij celmotiliteit voordat wordt besloten om meer middelen-veeleisende methoden uit te voeren. Bovendien maakt het ook kwantitatieve meting mogelijk van hoe genetische manipulaties (knock-out, knockdown of reddingsconstructies) van cytoskeletale eiwitten de cytoskeletale dynamiek beïnvloeden met behulp van een eenvoudig platform. De assay is een leerzaam model voor het onderzoeken van cytoskeletale dynamica in de context van celmigratie en kan worden gebruikt voor opheldering van de mechanismen en moleculen die ten grondslag liggen aan celmotiliteit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

De ontwikkeling en homeostase van meercellige organismen zijn afhankelijk van gecoördineerde regulatie van celmigratie. Celmigratie is een essentiële gebeurtenis in de constructie en regeneratie van weefsels en is van cruciaal belang voor de embryonale ontwikkeling, immunologische reacties en wondgenezing. Ontregeling van de celmotiliteit draagt bij aan pathologische aandoeningen, zoals chronische ontstekingen en kankermetastase. Celmigratie, weefselinvasie, axon- en dendrietuitgroei beginnen allemaal met actinepolymerisatie-gemedieerde celranduitsteeksels. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte, tijdbesparende methode voor de beeldvorming en kwantitatieve analyse van celranduitsteekseldynamiek tijdens het verspreiden. Deze methode meet discrete kenmerken van celrandmembraandynamica, zoals uitsteeksels, retracties en ruches, en kan worden gebruikt om te beoordelen hoe manipulaties van belangrijke actineregulatoren celranduitsteeksels in verschillende contexten beïnvloeden.

In het experiment beschreven in figuur 2 werden vereeuwigde MEF's verguld op schotels met glazen bodem voorgecoat met fibronectine om integrine-gemedieerde signalering te activeren, geblokkeerd door gedenatureerd BSA, om vrije potentiële locaties voor celadhesie te blokkeren die niet afhankelijk is van integrine-activering. Om de logaritmische groeifase te bereiken bij 70%-80% samenvloeiing van cellen op de dag van het experiment, werden 0,7 x 106 MEF's 16 uur voor het experiment...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Van de celranduitsteekseltest is aangetoond dat deze direct correleert met celmigratie. Daarom kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het identificeren van kritieke eiwitten en signaleringsmechanismen die betrokken zijn bij de beweeglijkheid van cellen. De methode is snel, eenvoudig, kosteneffectief en vereist geen fluorescerende etikettering of het gebruik van een dure fluorescerende microscoop.Michal Gendler, een student uit mijn laboratorium, demonstreert de procedure. Voeg twee milliliter van een normale zoutzuuroplossing toe in het midden van een glazen bodemschaal en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was het gerecht drie keer met twee milliliter PBS.Verdun fibronectine met een concentratie van 10 microgram per milliliter in PBS en voeg 200 microliter van de verdunde oplossing toe aan de glazen middenschaal. Incubeer gedurende een uur bij 37 graden Celsius. Bereid 1% BSA-oplossing en PBS voor en voer deze door een filter van 0,2 micrometer.Denatureer de oplossing door gedurende 30 minuten te broeden bij 70 graden Celsius in een voorverwarmd waterbad. Was de gecoate glazen bodemschaal drie keer met twee milliliter PBS. Voeg twee milliliter gedenatureerde BSA-oplossing toe en incubeer het gerecht gedurende een uur bij 37 graden Celsius.Was de glazen schaal drie keer met twee milliliter PBS. Vóór 16 tot 18 uur experiment met 0,7 miljoen cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 centimeter om 70 tot 80% confluentie te bereiken. Voeg de volgende dag twee milliliter trypsine-oplossing toe aan de weefselkweekplaat en incubeer gedurende twee tot drie minuten totdat de cellen losraken.Voeg vijf milliliter van het medium toe om de trypsine te inactiveren. Tel met behulp van een hemacytometer de cellen en plaat 20.000 cellen in twee milliliter van het volledige medium in een onderste schaal. Incubeer vervolgens de schaal met vergulde cellen in een incubator gedurende 15 minuten.Schakel de verwarmingseenheid in en stel deze een uur voor de beeldvorming in op 37 graden Celsius. Schakel ook de kooldioxide-eenheid in en stel deze in op 5% 10 minuten voordat u de beeldvorming uitvoert. Schakel de microscoop en camera in.Schakel de computer in en open de microscoopacquisitiesoftware. Stel de vergroting in op een 40X droog lensfasecontrast. Stel de totale filmduur in op 10 minuten met een tijdsinterval van vijf seconden.Plaats na 15 minuten incubatie de glazen bodemschaal met aangehechte cellen in een adapter en bevestig deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuven in de microscooptrap. Haal het deksel van de schotel eraf, plaats het deksel van de kooldioxide en open de kooldioxideklep.Zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Begin met filmacquisitie nadat je je op de cel hebt gericht. Om de beeldanalyse uit te voeren, selecteert u het rechte gereedschap in de beeldanalysesoftware en maakt u acht lijnen van 20 willekeurige eenheden loodrecht op de uitsteeksels in een radiale opstelling op elke 45 graden, inclusief lamellen en celrand.Ga in de hoofdwerkbalk naar afbeelding, selecteer Stapels en klik vervolgens op Reslice om een kymograafafbeelding te genereren die de beweging van afzonderlijke punten in het celmembraan beschrijft. Gebruik de kymograafafbeeldingen om het aantal uitsteeksels, retracties en ruches in elk van de acht gebieden in de cel gemarkeerd door de rasterlijnen te extraheren en handmatig te tellen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten.Bepaal de uitsteeksel persistentie, afstand en snelheid door kymografie analyse. Om de uitsteekselafstand te bepalen, trekt u loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M om de lengte van de lijn in pixels te meten en ervoor te zorgen dat de pixel-micrometerverhouding bekend is om de lengte in micrometers om te zetten.Kwantificering van uitsteeksels, reacties en ruches werd handmatig uitgevoerd per 10 minuten en de gemiddelde frequentie verkregen voor uitsteeksels en retracties was 5,1 en 2,1 voor ruches. De representatieve kymograaf had een uitsteekselafstand van ongeveer 4,8 micrometer en een uitsteekseltijd van ongeveer 0,6 minuten. Er wordt een voorbeeld weergegeven van een cel die van de analyse moet worden uitgesloten.Uit de kymografie-analyse bleek dat de cel niet aanwezig was in de verspreidingsfase en geen duidelijke membraanuitsteeksels vertoonde. Het belangrijkste is om de juiste cellen te kiezen voor beeldvorming. Een goede cel moet zich in de verspreidingsfase bevinden en mag andere cellen niet aanraken om cel-celcommunicatie en signalering te voorkomen.De methode kan worden gebruikt als een voorlopig hulpmiddel voor het testen van cytoskeletale dynamica waarbij celmotiliteit betrokken is voordat wordt besloten om meer resultaten uit te voeren die celmigratietests vereisen.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Live cell imaging van de F-actine Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Live-cel respons op mechanische stimulatie onderzocht door Integrated Optical en Atomic Force Microscopy

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Kwantitatieve Live Cell Fluorescentie-microscopie analyse van Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

Live cell imaging van primaire Rat Neonatale Cardiomyocytes Na Adenovirale en Lentiviral Transduction via confocale draaiende schijf Microscopie

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Meten van de stijfheid van<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mouse aorta&#39;s met behulp van Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Live-cell imaging en 3D analyse van angiotensine receptor type 1a Trafficking in getransfecteerde humane embryonale niercellen middels confocale microscopie

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Onderzoek naar de nadelige effecten van lage druk Plasma sterilisatie op het voortbestaan van Bacillus subtilis sporen met behulp van Live cel microscopie

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Exploitatie van de levende Imaging te Track kernen tijdens Myoblast differentiatie en Fusion

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...