Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse NIH MH115939, NS112121, NS105640 und R56MH122449-01A1 (an Anthony J. Koleske) und von der Israel Science Foundation (Stipendiennummer 1462/17 und 2142/21) (an Hava Gil-Henn) unterstützt.

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee (IACUC) der Bar-Ilan-Universität genehmigt.
HINWEIS: Eine grafische Schritt-für-Schritt-Darstellung des in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Zellkultur
HINWEIS: Die im Protokoll verwendeten Zellen sind embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus, die...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

Die Zellkanten-Protrusionsdynamik, bestehend aus Vorsprüngen, Rückzug und Rüschen, ist sowohl eine Voraussetzung als auch ein potenzielles geschwindigkeitsbegrenzendes Ereignis in der Zellmotilität. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode zur Messung der Dynamik von Zellrandvorsprüngen während der Ausbreitung. Diese Methode ermöglicht eine kurzzeitige Bildgebung, generiert eine erhebliche Datenmenge, erfordert keine fluoreszierende Markierung von Zellen oder teure Fluoreszenzmikroskopiegeräte und ...

Die Zellmigration ist ein kritischer Prozess, der die Entwicklung und Funktion aller lebenden Organismen steuert. Die Zellmigration tritt sowohl unter physiologischen Bedingungen wie Embryogenese, Wundheilung und Immunantwort als auch unter pathologischen Zuständen wie Krebsmetastasen und Autoimmunerkrankungen auf. Trotz Unterschieden in den Zelltypen, die an verschiedenen Migrationsereignissen beteiligt sind, teilen alle Zellmotilitätsereignisse ähnliche molekulare Mechanismen, die in der Evolution von Protozoen zu Säugetieren konserviert wurden und gemeinsame zytoskelettale Kontrollmechanismen beinhalten, die die Umgebung erfassen, auf Signale reagieren und das Zellverhalten als Reaktion modulieren können1.
Ein Anfangsstadium der Zellmigration kann die Bildung hochdynamischer Vorsprünge an der Vorderkante der Zelle sein. Hinter dem Lamellipodium befindet sich die Lamelle, die Aktin an Myosin II-vermittelte Kontraktilität koppelt und die Adhäsion auf das darunter liegende Substrat vermittelt. Lamellipodien werden durch extrazelluläre Reize wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Zelladhäsionsrezeptoren induziert und durch Aktinpolymerisation angetrieben, die die physikalische Kraft liefert, die die Plasmamembran vorantreibt2,3. Viele Signal- und Strukturproteine sind daran beteiligt; unter ihnen sind Rho-GTPasen, die koordiniert mit anderen Signalen wirken, um aktinregulierende Proteine wie den Arp 2/3-Komplex, Proteine der WASP-Familie und Mitglieder der Formin- und Spire-Familien in Lamellipodia2,4,5 zu aktivieren.
Neben der Aktinpolymerisation ist eine Myosin-II-Aktivität erforderlich, um kontraktile Kräfte am Lamellipodium und an der vorderen Lamelle zu erzeugen. Diese Kontraktionen, auch definiert als Zellrand-Rückzug, können auch aus der Depolymerisation von dendritischem Aktin an der Zellperipherie resultieren und sind entscheidend für die Entwicklung der lamellipodialen Vorderkante und ermöglichen es dem Protrusion, die Flexibilität der extrazellulären Matrix und anderer Zellen zu erkennen und die Richtung der Migration zu bestimmen6,7,8 . Zellrandvorsprünge, die sich nicht an das Substrat anheften können, bilden periphere Membranrüschen, blattartige Strukturen, die auf der ventralen Oberfläche von Lamellipodien und Lamellen erscheinen und sich relativ zur Migrationsrichtung rückwärts bewegen. Da sich das Lamellipodium nicht am Substrat festsetzt, bildet sich darunter ein hinteres Lamellipodium und drückt das erste Lamellipodium mechanisch in Richtung der oberen ventralen Oberfläche. Die Aktinfilamente in der Rüsche, die früher parallel zum Substrat waren, werden jetzt senkrecht zu ihm, und die Rüsche ist jetzt über dem vorrückenden Lamellipodium positioniert. Die Rüsche, die sich rückwärts bewegt, fällt zurück in das Zytosol und stellt einen zellulären Mechanismus zum Recycling von lamellipodialem Aktin dar9,10.
Hier beschreiben wir einen Assay zur Messung der Zellkanten-Protrusionsdynamik. Der Protrusionsassay verwendet Zeitraffer-Videomikroskopie, um die Protrusionsdynamik einzelner Zellkanten für 10 Minuten während der Spreizphase der Zelle zu messen. Die Protrusionsdynamik wird analysiert, indem Kymographen aus diesen Filmen generiert werden. Im Prinzip liefert ein Kymograph detaillierte quantitative Daten von sich bewegenden Partikeln in einem raumzeitlichen Diagramm, um ein qualitatives Verständnis der Zellranddynamik zu erhalten. Die Intensität des sich bewegenden Teilchens wird für alle Bildstapel in einem Zeit-Raum-Diagramm dargestellt, wobei die X-Achse und die Y-Achse Zeit bzw. Entfernung darstellen11. Diese Methode verwendet eine manuelle Kymographenanalyse mit ImageJ, um detaillierte quantitative Daten zu erhalten, die das Abrufen von Informationen aus Filmen und Bildern bei niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis und / oder hoher Merkmalsdichte sowie die Analyse von Bildern ermöglichen, die in Phasenkontrast-Lichtmikroskopie oder schlechter Bildqualität aufgenommen wurden.
Der hierin beschriebene Zellkanten-Protrusionsdynamik-Assay ist eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode. Als solches und weil es nachweislich direkt mit der Zellmigration korreliert11,12, kann es als vorläufige Methode zum Testen der Zytoskelettdynamik verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt ist, bevor entschieden wird, ressourcenintensivere Methoden durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht es auch die quantitative Messung, wie genetische Manipulationen (Knockout-, Knockdown- oder Rettungskonstrukte) von Zytoskelettproteinen die Zytoskelettdynamik mit einer einfachen Plattform beeinflussen. Der Assay ist ein lehrreiches Modell zur Erforschung der Zytoskelettdynamik im Kontext der Zellmigration und könnte zur Aufklärung der Mechanismen und Moleküle verwendet werden, die der Zellmotilität zugrunde liegen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

Die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen beruht auf einer koordinierten Regulation der Zellmigration. Die Zellmigration ist ein wesentliches Ereignis beim Aufbau und der Regeneration von Geweben und entscheidend für die Embryonalentwicklung, die immunologischen Reaktionen und die Wundheilung. Eine Dysregulation der Zellmotilität trägt zu pathologischen Störungen wie chronischen Entzündungen und Krebsmetastasen bei. Zellmigration, Gewebeinvasion, Axon- und Dendritenauswuchs beginnen alle mit Aktinpolymerisations-vermittelten Zellrandvorsprüngen. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode zur bildgebenden und quantitativen Analyse der Zellkantenprotrusionsdynamik während der Ausbreitung. Diese Methode misst diskrete Merkmale der Zellkantenmembrandynamik, wie Vorsprünge, Rückzug und Rüschen, und kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich Manipulationen von Schlüssel-Aktinregulatoren auf Zellkantenvorsprünge in verschiedenen Kontexten auswirken.

In dem in Abbildung 2 beschriebenen Experiment wurden immortalisierte MEFs auf Glasbodenschalen plattiert, die mit Fibronektin vorbeschichtet waren, um die durch denaturierte BSA blockierte integrinvermittelte Signalübertragung zu aktivieren, um freie potenzielle Stellen für die Zelladhäsion zu blockieren, die nicht von der Integrinaktivierung abhängig ist. Um die logarithmische Wachstumsphase bei 70%-80% Zusammenfluss von Zellen am Tag des Experiments zu erreichen, wurden 16 h vor dem E...

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Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die dynamischen Parameter (Vorsprünge, Retraktionen, Rüschen) von Vorsprüngen am Rand von sich ausbreitenden Zellen zu messen.

Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Es hat sich gezeigt, dass der Zellrand-Protrusionsassay direkt mit der Zellmigration korreliert. Daher kann es als vorläufige Methode zur Identifizierung kritischer Proteine und Signalmechanismen verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt sind. Die Methode ist schnell, einfach, kostengünstig und erfordert keine fluoreszierende Markierung oder Verwendung eines teuren Fluoreszenzmikroskops.Das Verfahren wird Michal Gendler, ein Student aus meinem Labor, demonstrieren. Fügen Sie zwei Milliliter einer normalen Salzsäurelösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Geschirr dreimal mit zwei Millilitern PBS.Verdünnen Sie Fibronektin bei 10 Mikrogramm pro Milliliterkonzentration in PBS und fügen Sie 200 Mikroliter der verdünnten Lösung in die Glasmittelschale hinzu. Eine Stunde bei 37 Grad Celsius inkubieren. Bereiten Sie 1% BSA-Lösung und PBS vor und führen Sie es durch einen 0,2-Mikrometer-Filter.Denaturieren Sie die Lösung, indem Sie bei 70 Grad Celsius für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad inkubieren. Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Fügen Sie zwei Milliliter denaturierte BSA-Lösung hinzu und inkubieren Sie die Schale bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Waschen Sie die Glasschale dreimal mit zwei Millilitern PBS. Vor 16 bis 18 Stunden Experiment bei 0,7 Millionen Zellen pro 10 Zentimeter Durchmesser Gewebekulturplatte, um 70 bis 80% Konfluenz zu erreichen. Am nächsten Tag zwei Milliliter Trypsinlösung in die Gewebekulturplatte geben und zwei bis drei Minuten inkubieren, bis sich die Zellen ablösen.Fügen Sie fünf Milliliter des Mediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren. Zählen Sie mit einem Hämacytometer die Zellen und die Platte 20.000 Zellen in zwei Millilitern des gesamten Mediums in einer unteren Schale. Dann inkubieren Sie die Schale mit plattierten Zellen in einem Inkubator für 15 Minuten.Schalten Sie das Heizgerät ein und stellen Sie es eine Stunde vor der Bildgebung auf 37 Grad Celsius ein. Schalten Sie auch die Kohlendioxideinheit ein und stellen Sie sie auf 5% 10 Minuten vor der Bildgebung ein. Schalten Sie das Mikroskop und die Kamera ein.Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware. Stellen Sie die Vergrößerung auf einen 40-fachen Trockenlinsenphasenkontrast ein. Legen Sie die Gesamtdauer des Films auf 10 Minuten mit einem Zeitintervall von fünf Sekunden fest.Nach 15 Minuten Inkubation die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in einen Adapter geben und fixieren. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in die Schlitze im Mikroskoptisch. Nehmen Sie den Schalendeckel ab, setzen Sie den Kohlendioxiddeckel auf und öffnen Sie das Kohlendioxidventil.Suchen Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Beginnen Sie mit der Filmakquisition, nachdem Sie sich auf die Zelle konzentriert haben. Um die Bildanalyse durchzuführen, wählen Sie das gerade Werkzeug in der Bildanalysesoftware und machen Sie acht Linien von 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen in einer radialen Anordnung bei allen 45 Grad, einschließlich Lamelle und Zellkante.Gehen Sie in der Hauptsymbolleiste zum Bild, wählen Sie Stacks und klicken Sie dann auf Reslice, um ein Kymographenbild zu erstellen, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt. Extrahieren und zählen Sie anhand der Kymographenbilder die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche in der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind, manuell und manuell. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 Minuten dar.Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Um den Vorsprung zu bestimmen, zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M, um die Länge der Linie in Pixel zu messen und sicherzustellen, dass das Verhältnis von Pixel zu Mikrometer bekannt ist, um die Länge in Mikrometer umzuwandeln.Die Quantifizierung von Vorsprüngen, Reaktionen und Rüschen wurde manuell pro 10 Minuten durchgeführt, und die durchschnittliche Häufigkeit für Vorsprünge und Rückzug betrug 5,1 und 2,1 für Rüschen. Der repräsentative Kymograph hatte einen Protrusionsabstand von etwa 4,8 Mikrometern und eine Protrusionszeit von etwa 0,6 Minuten. Ein Beispiel für eine Zelle, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollte, wird dargestellt.Die Kymographie-Analyse ergab, dass die Zelle in ihrer Ausbreitungsphase nicht vorhanden war und keine klaren Membranvorsprünge zeigte. Das Wichtigste ist, die richtigen Zellen für die Bildgebung auszuwählen. Eine richtige Zelle sollte sich in ihrer Ausbreitungsphase befinden und andere Zellen nicht berühren, um Zell-Zell-Kommunikation und Signalisierung zu vermeiden.Die Methode kann als vorläufiges Werkzeug zum Testen der zytoskelettalen Dynamik mit Zellmotilität verwendet werden, bevor entschieden wird, mehr Ergebnisse durchzuführen, die Zellmigrationsassays erfordern.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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