Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NIH MH115939, NS112121, NS105640, ו R56MH122449-01A1 (לאנתוני ג'יי קולסקה) ומהקרן הישראלית למדע (מענקים מספר 1462/17 ו-2142/21) (לחוה גיל-חן).

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת בר-אילן.
הערה: תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך המתואר בסעיף זה מופיע באיור 1.
1. תרבות התא
הערה: התאים המשמשים בפרוטו...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

דינמיקת בליטה בקצה התא, המורכבת מהבלטות, נסיגה וקפלים, היא גם תנאי מוקדם וגם אירוע פוטנציאלי להגבלת קצב בתנועתיות התאים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה למדידת הדינמיקה של בליטות בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מאפשרת הדמיה לזמן קצר, מייצרת כמות משמעותית של נתונים, אינה דורשת תיוג פלואור...

הגירת תאים היא תהליך קריטי השולט בהתפתחות ובתפקוד של כל האורגניזמים החיים. נדידת תאים מתרחשת הן במצבים פיזיולוגיים, כגון עוברים, ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, והן במצבים פתולוגיים, כגון גרורות סרטן ומחלות אוטואימוניות. למרות ההבדלים בסוגי התאים שלוקחים חלק באירועים נודדים שונים, כל אירועי תנועתיות התאים חולקים מנגנונים מולקולריים דומים, שנשמרו באבולוציה מפרוטוזואה ליונקים, וכוללים מנגנוני בקרה ציטו-שלדיים נפוצים שיכולים לחוש את הסביבה, להגיב לאותותים ולווסת את התנהגות התאים בתגובה1.
שלב ראשוני בנדידת תאים יכול להיות היווצרות של בליטות דינמיות מאוד בקצה המוביל של התא. מאחורי lamellipodium ניתן למצוא את lamella, אשר זוגות פועלים כדי myosin II בתיווך התכווצות ומתווך הידבקות למצע הבסיסי. Lamellipodia מושרה על ידי גירויים חוץ תאיים כגון גורמי גדילה, ציטוקינים, קולטני הידבקות תאים, מונעים על ידי פילמור actin, אשר מספק את הכוח הפיזי שדוחף את קרום הפלזמה קדימה2,3. חלבונים רבים מאותתים ומבניים היו מעורבים בכך; ביניהם הם Rho GTPases, אשר פועלים בתיאום עם אותות אחרים להפעלת חלבונים מווסת actin כגון קומפלקס Arp 2/3, חלבונים משפחתיים WASP, ובני משפחות פורמן וספיר ב lamellipodia2,4,5.
בנוסף פילמור אקטין, פעילות myosin II נדרשת ליצירת כוחות התכווצות ב lamellipodium ואת lamella הקדמי. התכווצויות אלה, המוגדרות גם כנסיגה בקצה התא, יכולות גם לנבוע מדה-פילמוריזציה של אקטין דנדריטי בפריפריה של התא והן קריטיות לפיתוח הקצה המוביל של lamellipodial ולאפשר לבלט לחוש את הגמישות של המטריצה החוץ-תאית ותאים אחרים ולקבוע את כיוון הנדידה6,7,8 . בליטות בקצה התא שאינן יכולות להיצמד למצע ייצרו קפלים של קרום היקפי, מבנים דמויי גיליון המופיעים על פני השטח הגחוניים של lamellipodia ו lamella ולנוע אחורה ביחס לכיוון הנדידה. כאשר הלמליפודיום אינו מתחבר למצע, נוצר מתחתיו למליפודיום אחורי ודוחף באופן מכני את הלאמליפודיום הראשון לכיוון פני השטח הגחוניים העליונים. חוטי האקטין בקפלים שבעבר היו מקבילים למצע הופכים כעת לאנכים לו, והרכישה ממוקמת כעת מעל למליפודיום המתקדם. ההמולה הנעה אחורה חוזרת לציטוסול ומייצגת מנגנון תאי למיחזור אקטין לאמליפודיאלי9,10.
כאן, אנו מתארים בדיקה למדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא. בדיקת הבליטה משתמשת במיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן כדי למדוד דינמיקת בליטה בקצה תא בודד במשך 10 דקות במהלך שלב ההתפשטות של התא. דינמיקת בליטה מנותחת על ידי יצירת kymographs מסרטים אלה. באופן עקרוני, קימוגרף מקנה נתונים כמותיים מפורטים של חלקיקים נעים בעלילה מרחבית כדי להניב הבנה איכותית של הדינמיקה של קצה התא. עוצמת החלקיק הנע מותווה עבור כל ערימות התמונה בזמן לעומת תרשים חלל, כאשר ציר ה- X וציר ה- Y מייצגים זמן ומרחק, בהתאמה11. שיטה זו משתמשת בניתוח קימוגרפיה ידני עם ImageJ כדי לקבל נתונים כמותיים מפורטים, המאפשרים אחזור מידע מסרטים ותמונות במקרה של יחס אות לרעש נמוך ו/או צפיפות תכונות גבוהה, וניתוח תמונות שנרכשו במיקרוסקופיית אור ניגודיות פאזה או באיכות תמונה ירודה.
בדיקת הדינמיקה של בליטה בקצה התא המתוארת כאן היא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית. ככזה, ומכיוון שהוא הוכח בקורלציה ישירה עם העברת תאים11,12, זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד cytoskeal מעורב תנועתיות התא לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר משאבים. יתר על כן, הוא גם מאפשר מדידה כמותית של האופן שבו מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט או מבני הצלה) של חלבונים ציטוסקיליים משפיעים על הדינמיקה של השלד באמצעות פלטפורמה פשוטה. הבדיקה היא מודל מאלף לחקר הדינמיקה של השלד הציטוטי בהקשר של נדידת תאים ויכולה לשמש להבהרת המנגנונים והמולקולות שבבסיס תנועתיות התאים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

ההתפתחות וההומיאוסטזיס של אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על רגולציה מתואמת של נדידת תאים. נדידת תאים היא אירוע חיוני בבנייה והתחדשות של רקמות, והיא קריטית בהתפתחות העוברית, בתגובות אימונולוגיות ובריפוי פצעים. דיסרגציה של תנועתיות התא תורמת להפרעות פתולוגיות, כגון דלקת כרונית וגרורות סרטן. נדידת תאים, פלישת רקמות, אקסון וצמיחת דנדריט יוזמות כולן עם בליטות של קצה התא בתיווך אקטין פילמור. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה וחוסכת זמן להדמיה וניתוח כמותי של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מודדת תכונות נפרדות של דינמיקת קרום קצה התא, כגון בליטות, נסיגה וקפלים, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד מניפולציות של רגולטורים actin מפתח להשפיע על בליטות קצה התא בהקשרים מגוונים.

בניסוי המתואר באיור 2, MEFs מונצחים היו מצופים על כלים עם תחתית זכוכית מצופים מראש בפיברונקטין כדי להפעיל איתותים בתיווך אינטגרין, שנחסמו על ידי BSA מפוטר, כדי לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות בתאים שאינם תלויים בהפעלה אינטגרית. כדי להגיע לשלב הצמיחה הלוגריתמי במפגש ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

בדיקת הבליטה של קצה התא הוכחה כמתאמת ישירות עם העברת תאים. לכן זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לזיהוי חלבונים קריטיים ומנגנוני איתות המעורבים תנועתיות התא. השיטה מהירה, פשוטה, חסכונית ואינה דורשת תיוג פלואורסצנטי או שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי יקר.מי שתדגים את ההליך תהיה מיכל גנדלר, סטודנטית מהמעבדה שלי. מוסיפים שני מיליליטרים של תמיסת חומצה הידרוכלורית רגילה אחת במרכז צלחת תחתונה מזכוכית ודגורים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את המנה שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS.מדללים פיברונקטין בריכוז של 10 מיקרוגרם למיליליטר ב-PBS ומוסיפים 200 מיקרוליטרים של התמיסה המדוללת לצלחת מרכז הזכוכית. דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. הכן פתרון 1%BSA ו- PBS והעבר אותו דרך מסנן 0.2 מיקרומטר.Denature את הפתרון על ידי דגירה ב 70 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה עם שני מיליליטר של PBS שלוש פעמים. מוסיפים שני מיליליטר של תמיסת BSA מפורקת ודוללים את המנה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לשטוף את צלחת הזכוכית עם שני מיליליטרים של PBS שלוש פעמים. לפני 16 עד 18 שעות של ניסוי ב 0.7 מיליון תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ כדי להשיג 70 עד 80% מפגש. למחרת, מוסיפים שני מיליליטר של פתרון טריפסין לצלחת תרבית הרקמה ודגרים במשך שתיים עד שלוש דקות עד שהתאים מתנתקים.הוסף חמישה מיליליטר של המדיום כדי להשבית את הטריפסין. באמצעות hemacytometer, לספור את התאים צלחת 20, 000 תאים בשני מיליליטר של המדיום השלם בצלחת התחתונה. לאחר מכן לדגור על המנה עם תאים מצופים באינקובטור במשך 15 דקות.הפעל את יחידת החימום והגדר אותה ב 37 מעלות צלזיוס שעה אחת לפני הדמיה. כמו כן, להפעיל את יחידת דו תחמוצת הפחמן ולהגדיר אותו ב 5%10 דקות לפני הדמיה. הפעל את המיקרוסקופ והמצלמה.הפעל את המחשב ופתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ. הגדר את ההגדלה על ניגודיות פאזה של עדשה יבשה פי 40. הגדר את משך הסרט הכולל ל- 10 דקות עם מרווח זמן של חמש שניות.לאחר 15 דקות של דגירה, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך מתאם ולתקן את זה. הכנס את המתאם עם המנה לחריצים בשלב המיקרוסקופ. מורידים את כיסוי המנה, מניחים את מכסה הפחמן הדו-חמצני ופותחים את שסתום הפחמן הדו-חמצני.אתר תא מתאים להדמיה. התחל רכישת סרטים לאחר התמקדות בתא. כדי לבצע את ניתוח התמונה, בחר את הכלי הישר בתוכנת ניתוח התמונה והפוך שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות בניצב לבליטות בסידור רדיאלי בכל 45 מעלות, כולל lamella וקצה תא.בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה, בחר ערימות ולאחר מכן לחץ על Reslice כדי ליצור תמונת kymograph המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא. באמצעות תמונות kymograph, לחלץ ולספור באופן ידני את מספר בליטות, נסיגה וקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא מסומן על ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את התדירות של בליטות, נסיגה וקפלים לכל 10 דקות.קבעו את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על ידי ניתוח קימוגרפיה. כדי לקבוע את מרחק הבליטה, לצייר קו מאונך מבסיס הבליטה אל הפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים וודא שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע כממיר את האורך במיקרומטרים.כימות הבלטות, התגובות והקפלים בוצע באופן ידני לכל 10 דקות והתדירות הממוצעת שהושגה עבור בליטות ונסיגה הייתה 5.1 ו -2.1 לקפלים. לקימוגרפיה הייצוגית היה מרחק בליטה של כ-4.8 מיקרומטר וזמן בליטה של כ-0.6 דקות. דוגמה לתא שיש לא לכלול בניתוח מיוצגת.ניתוח הקימוגרף גילה כי התא לא היה נוכח בשלב ההתפשטות שלו ולא הראה בליטות ממברנה ברורות. הדבר החשוב ביותר הוא לבחור תאים נכונים להדמיה. תא תקין צריך להיות בשלב ההתפשטות שלו ולא צריך לגעת בתאים אחרים כדי למנוע תקשורת תא-תא ואיתות.השיטה יכולה לשמש ככלי ראשוני לבדיקת דינמיקה של שלד ציטו-שלד המערבת תנועתיות תאים לפני שתחליט לבצע תוצאות נוספות הדורשות בדיקות של העברת תאים.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

דימות של תא חי F-אקטין Dynamics באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

תגובת תא חי כדי גירוי מכני שנלמדה על ידי מיקרוסקופית כוח משולב אופטי אטומית

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

כמותי תא חי פלואורסצנטי, מיקרוסקופ ניתוח של שמרים ביקוע

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

ההדמיה של תא חי של ראשוני cardiomyocytes ילודים החולדה בעקבות adenoviral וlentiviral התמרה באמצעות דיסק מסתובב confocal מיקרוסקופית

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

חיים התא מיקרוסקופ פלורסצנטיות לבחון תהליכים חיוניים במהלך צמיחת תאים מיקרוביאלי

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

בליטה מיקרוסקופ כוח: שיטה לכמת כוחות שפותחה על ידי בליטות תא

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

ניצול הדמיה בשידור חי על המסלול גרעינים במהלך התמיינות Myoblast, פיוז'ן

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...