Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (ad Anthony J. Koleske) e dalla Israel Science Foundation (sovvenzioni numero 1462/17 e 2142/21) (a Hava Gil-Henn).

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Bar-Ilan.
Nota : nella Figura 1 viene visualizzata una rappresentazione grafica dettagliata della procedura descritta in questa sezione.
1. Coltura cellulare
NOTA: Le cellule utilizzate nel protocollo sono fibroblasti embrionali di topo (MEF) c...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

La dinamica di protrusione del bordo cellulare, composta da protrusioni, retrazioni e volant, è sia un prerequisito che un potenziale evento limitante la velocità nella motilità cellulare. Qui descriviamo un metodo rapido e semplice per misurare la dinamica delle sporgenze del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo consente l'imaging a breve termine, genera una quantità significativa di dati, non richiede l'etichettatura fluorescente delle cellule o costose apparecchiature di microscopia fluorescente e ...

La migrazione cellulare è un processo critico che controlla lo sviluppo e la funzione di tutti gli organismi viventi. La migrazione cellulare avviene sia in condizioni fisiologiche, come l'embriogenesi, la guarigione delle ferite e la risposta immunitaria, sia in condizioni patologiche, come metastasi tumorali e malattie autoimmuni. Nonostante le differenze nei tipi di cellule che prendono parte a diversi eventi migratori, tutti gli eventi di motilità cellulare condividono meccanismi molecolari simili, che sono stati conservati nell'evoluzione dai protozoi ai mammiferi e coinvolgono meccanismi di controllo citoscheletrico comuni in grado di rilevare l'ambiente, rispondere ai segnali e modulare il comportamento cellulare in risposta1.
Una fase iniziale della migrazione cellulare può essere la formazione di sporgenze altamente dinamiche sul bordo anteriore della cella. Dietro il lamellipodio si trova la lamella, che accoppia l'actina alla contrattilità mediata dalla miosina II e media l'adesione al substrato sottostante. Le lamellipodia sono indotte da stimoli extracellulari come fattori di crescita, citochine e recettori di adesione cellulare e sono guidate dalla polimerizzazione dell'actina, che fornisce la forza fisica che spinge la membrana plasmatica in avanti2,3. Molte proteine di segnalazione e strutturali sono state implicate in questo; tra questi ci sono rho GTPasi, che agiscono in coordinate con altri segnali per attivare proteine che regolano l'actina come il complesso Arp 2/3, le proteine della famiglia WASP e membri delle famiglie Formin e Spire in lamellipodia2,4,5.
Oltre alla polimerizzazione dell'actina, l'attività della miosina II è necessaria per generare forze contrattili al lamellipodio e alla lamella anteriore. Queste contrazioni, definite anche come retrazioni del bordo cellulare, possono anche derivare dalla depolimerizzazione dell'actina dendritica alla periferia cellulare e sono fondamentali per lo sviluppo del bordo d'attacco lamellipodiale e consentire alla protrusione di rilevare la flessibilità della matrice extracellulare e di altre cellule e determinare la direzione della migrazione6,7,8 . Le sporgenze del bordo cellulare che non possono attaccarsi al substrato formeranno volant periferici della membrana, strutture simili a fogli che appaiono sulla superficie ventrale di lamellipodi e lamelle e si muovono all'indietro rispetto alla direzione della migrazione. Poiché il lamellipodio non riesce ad attaccarsi al substrato, un lamellipodio posteriore si forma sotto di esso e spinge meccanicamente il primo lamellipodio verso la superficie ventrale superiore. I filamenti di actina nel volant che erano precedentemente paralleli al substrato ora diventano perpendicolari ad esso, e il volant è ora posizionato sopra il lamellipodio che avanza. Il volant che si muove all'indietro ricade nel citosol e rappresenta un meccanismo cellulare per il riciclo dell'actina lamellipodiale9,10.
Qui, descriviamo un test per la misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare. Il test di protrusione utilizza la microscopia video time-lapse per misurare la dinamica di protrusione del bordo della singola cellula per 10 minuti durante la fase di diffusione della cellula. Le dinamiche di protrusione vengono analizzate generando cimografi da questi filmati. In linea di principio, un chimografo impartisce dati quantitativi dettagliati di particelle in movimento in un grafico spaziotemporale per ottenere una comprensione qualitativa della dinamica dei bordi cellulari. L'intensità della particella in movimento viene tracciata per tutte le pile di immagini in un grafico tempo rispetto allo spazio, dove l'asse X e l'asse Y rappresentano rispettivamente il tempo e la distanza11. Questo metodo utilizza un'analisi manuale del kymograph con ImageJ per ottenere dati quantitativi dettagliati, consentendo il recupero di informazioni da filmati e immagini in caso di basso rapporto segnale-rumore e / o alta densità di funzionalità, e l'analisi di immagini acquisite in microscopia a luce a contrasto di fase o scarsa qualità dell'immagine.
Il test della dinamica di protrusione del bordo cellulare descritto qui è un metodo veloce, semplice ed economico. Come tale, e poiché è stato dimostrato che è direttamente correlato con la migrazione cellulare11,12, può essere utilizzato come metodo preliminare per testare le dinamiche citoscheletriche coinvolte nella motilità cellulare prima di decidere di eseguire metodi più esigenti in termini di risorse. Inoltre, consente anche la misurazione quantitativa di come le manipolazioni genetiche (knockout, knockdown o costrutti di salvataggio) delle proteine citoscheletriche influiscono sulla dinamica citoscheletrica utilizzando una piattaforma semplice. Il test è un modello istruttivo per esplorare la dinamica citoscheletrica nel contesto della migrazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per chiarire i meccanismi e le molecole alla base della motilità cellulare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

Lo sviluppo e l'omeostasi degli organismi multicellulari si basano sulla regolazione coordinata della migrazione cellulare. La migrazione cellulare è un evento essenziale nella costruzione e nella rigenerazione dei tessuti ed è fondamentale per lo sviluppo embrionale, le risposte immunologiche e la guarigione delle ferite. La disregolazione della motilità cellulare contribuisce a disturbi patologici, come l'infiammazione cronica e le metastasi del cancro. La migrazione cellulare, l'invasione tissutale, l'assone e la crescita del dendrite iniziano tutti con sporgenze del bordo cellulare mediate dalla polimerizzazione dell'actina. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e che consente di risparmiare tempo per l'imaging e l'analisi quantitativa delle dinamiche di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo misura le caratteristiche discrete della dinamica della membrana del bordo cellulare, come sporgenze, retrazioni e volant, e può essere utilizzato per valutare come le manipolazioni dei regolatori di actina chiave influenzano le sporgenze del bordo cellulare in diversi contesti.

Nell'esperimento descritto nella Figura 2, i MEF immortalizzati sono stati placcati su piatti con fondo di vetro pre-rivestiti con fibronectina per attivare la segnalazione mediata dall'integrina, bloccata dalla BSA denaturata, per bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare che non dipende dall'attivazione dell'integrina. Per raggiungere la fase di crescita logaritmica al 70%-80% di confluenza delle cellule il giorno dell'esperimento, 0,7 x 106 MEF sono stati placc...

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Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.

Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Il test di protrusione del bordo cellulare ha dimostrato di essere direttamente correlato alla migrazione cellulare. Pertanto può essere utilizzato come metodo preliminare per identificare proteine critiche e meccanismi di segnalazione coinvolti nella motilità cellulare. Il metodo è veloce, semplice, economico e non richiede l'etichettatura fluorescente o l'utilizzo di un costoso microscopio fluorescente.A dimostrare la procedura sarà Michal Gendler, uno studente del mio laboratorio. Aggiungere due millilitri di una normale soluzione di acido cloridrico al centro di un piatto con fondo di vetro e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare il piatto tre volte con due millilitri di PBS.Diluire la fibronectina a 10 microgrammi per millilitro di concentrazione in PBS e aggiungere 200 microlitri della soluzione diluita alla parabola centrale di vetro. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Preparare la soluzione 1%BSA e PBS e passarla attraverso un filtro da 0,2 micrometri.Denaturare la soluzione incubando a 70 gradi Celsius per 30 minuti in un bagno d'acqua preriscaldato. Lavare il piatto inferiore in vetro rivestito con due millilitri di PBS tre volte. Aggiungere due millilitri di soluzione BSA denaturata e incubare il piatto a 37 gradi Celsius per un'ora.Lavare il piatto di vetro con due millilitri di PBS tre volte. Prima di 16-18 ore di esperimento a 0,7 milioni di cellule per piastra di coltura tissutale di 10 centimetri di diametro per raggiungere il 70-80% di confluenza. Il giorno successivo, aggiungere due millilitri di soluzione di tripsina alla piastra di coltura tissutale e incubare per due o tre minuti fino a quando le cellule si staccano.Aggiungere cinque millilitri del mezzo per inattivare la tripsina. Usando un emacitometro, conta le cellule e la piastra 20.000 cellule in due millilitri del mezzo completo in un piatto inferiore. Quindi incubare il piatto con cellule placcate in un'incubatrice per 15 minuti.Accendere l'unità di riscaldamento e impostarla a 37 gradi Celsius un'ora prima dell'imaging. Inoltre, accendere l'unità di anidride carbonica e impostarla al 5% 10 minuti prima dell'imaging. Accendere il microscopio e la fotocamera.Accendere il computer e aprire il software di acquisizione del microscopio. Impostare l'ingrandimento su un contrasto di fase dell'obiettivo secco 40X. Imposta la durata totale del filmato su 10 minuti con un intervallo di tempo di cinque secondi.Dopo 15 minuti di incubazione, posizionare il piatto di fondo di vetro con cellule aderenti in un adattatore e fissarlo. Inserire l'adattatore con la parabola nelle fessure dello stadio del microscopio. Togliere il coperchio del piatto, posizionare il coperchio dell'anidride carbonica e aprire la valvola dell'anidride carbonica.Individuare una cella appropriata per l'imaging. Avviare l'acquisizione del filmato dopo essersi concentrati sulla cella. Per eseguire l'analisi dell'immagine, selezionare lo strumento dritto nel software di analisi delle immagini e creare otto linee di 20 unità arbitrarie perpendicolari alle sporgenze in una disposizione radiale ogni 45 gradi, tra cui lamella e bordo della cella.Nella barra degli strumenti principale, vai all'immagine, seleziona Stacks e quindi fai clic su Reslice per generare un'immagine del kymograph che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare. Utilizzando le immagini del kymograph, estrarre e contare manualmente il numero di sporgenze, retrazioni e volant in ciascuna delle otto regioni della cella contrassegnate dalle linee della griglia. Questi numeri rappresentano la frequenza di sporgenze, retrazioni e volant per 10 minuti.Determinare la persistenza, la distanza e la velocità della protrusione mediante l'analisi della chimografia. Per determinare la distanza di protrusione, disegnate la linea perpendicolare dalla base della protrusione al picco più alto della protrusione. Premere M per misurare la lunghezza della linea in pixel e assicurarsi che il rapporto pixel/micrometro sia noto per convertire la lunghezza in micrometri.La quantificazione di sporgenze, reazioni e volant è stata eseguita manualmente per 10 minuti e la frequenza media ottenuta per sporgenze e retrazioni è stata di 5,1 e 2,1 per volant. Il kymograph rappresentativo aveva una distanza di protrusione di circa 4,8 micrometri e un tempo di protrusione di circa 0,6 minuti. Viene rappresentato un esempio di cella che deve essere esclusa dall'analisi.L'analisi della chimografia ha rivelato che la cellula non era presente nella sua fase di diffusione e non ha mostrato alcuna chiara protrusione della membrana. La cosa più importante è scegliere le cellule corrette per l'imaging. Una cellula corretta dovrebbe essere nella sua fase di diffusione e non dovrebbe toccare altre cellule per evitare la comunicazione e la segnalazione cellula-cellula.Il metodo può essere utilizzato come strumento preliminare per testare la dinamica citoscheletrica che coinvolge la motilità cellulare prima di decidere di eseguire più risultati richiedendo saggi di migrazione cellulare.

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