Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

이 작업은 NIH MH115939, NS112121, NS105640 및 R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske)과 이스라엘 과학 재단 (보조금 번호 1462/17 및 2142/21) (Hava Gil-Henn)의 보조금으로 지원되었습니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 Bar-Ilan University의 IACUC (Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 절에서 설명하는 절차의 단계별 그래픽 묘사가 그림 1에 나타납니다.
1. 세포 배양
참고: 프로토콜에 사용된 세포는 야생형 C57BL/6 마우스의 E11.5-13.5 배아로부터 생성된 마우스 배아 섬유?...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. 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Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

돌출부, 수축 및 주름으로 구성된 세포 가장자리 돌출 역학은 세포 운동성에서 전제 조건이자 잠재적 인 속도 제한 사건입니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌기의 역학을 측정하기위한 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 단시간 이미징을 가능하게 하고, 상당한 양의 데이터를 생성하며, 세포의 형광 표지 또는 고가의 형광 현미경 검사 장비를 필요로 하지 않으며, 더 많은 자원?...

세포 이동은 모든 살아있는 유기체의 발달과 기능을 제어하는 중요한 과정입니다. 세포 이동은 배아 발생, 상처 치유 및 면역 반응과 같은 생리적 조건과 암 전이 및 자가면역 질환과 같은 병리학적 조건 모두에서 발생합니다. 서로 다른 철새 사건에 참여하는 세포 유형의 차이에도 불구하고, 모든 세포 운동성 사건은 원생 동물에서 포유류로의 진화에서 보존 된 유사한 분자 메커니즘을 공유하며, 환경을 감지하고, 신호에 반응하고, 반응에서 세포 행동을 조절할 수있는 일반적인 세포 골격 조절 메커니즘을 포함합니다1.
세포 이동의 초기 단계는 세포의 최첨단에서 매우 역동적인 돌출부를 형성하는 것일 수 있다. 라멜리 포디움 뒤에는 액틴을 미오신 II 매개 수축성에 결합시키고 기본 기질에 대한 접착을 매개하는 라멜라를 찾을 수 있습니다. 라멜리포디아는 성장 인자, 사이토카인 및 세포 부착 수용체와 같은 세포외 자극에 의해 유도되며, 액틴 중합에 의해 구동되며, 이는 원형질막을 앞으로 밀어내는 물리적 힘을 제공한다2,3. 많은 신호전달 및 구조 단백질이 이에 연루되어 있다; 그 중에는 Arp 2/3 복합체, WASP 패밀리 단백질 및 lamellipodia2,4,5의 Formin 및 Spire 패밀리의 구성원과 같은 액틴 조절 단백질을 활성화하기 위해 다른 신호와 조화롭게 작용하는 Rho GTPases가 있습니다.
액틴 중합 이외에, 미오신 II 활성은 라멜리포디움 및 전방 라멜라에서 수축력을 생성하는데 요구된다. 세포 가장자리 수축으로도 정의되는 이러한 수축은 또한 세포 주변부에서 수지상 액틴의 탈중합으로 인해 발생할 수 있으며 lamellipodial 리딩 에지를 개발하고 돌출부가 세포 외 매트릭스 및 기타 세포의 유연성을 감지하고 이동 방향을 결정할 수있게하는 데 중요합니다6,7,8 . 기질에 부착 할 수없는 세포 가장자리 돌출부는 말초 막 프릴, 라멜리 포디아 및 라멜라의 복부 표면에 나타나는 시트형 구조를 형성하고 이동 방향에 따라 뒤로 움직입니다. 라멜리포디움이 기판에 부착되지 않으면 그 아래에 후부 라멜리포디움이 형성되어 첫 번째 라멜리포디움을 상부 복부 표면쪽으로 기계적으로 밀어 넣습니다. 이전에 기질과 평행했던 프릴의 액틴 필라멘트는 이제 그것에 수직이되고, 프릴은 이제 전진하는 라멜리 포디움 위에 위치합니다. 뒤로 움직이는 프릴은 시토졸로 다시 떨어지며 라멜리포디얼 액틴9,10을 재활용하기 위한 세포 메커니즘을 나타낸다.
여기에서, 우리는 세포 가장자리 돌출 역학의 측정을 위한 검정을 기술한다. 돌출 분석은 시간 경과 비디오 현미경을 사용하여 세포의 확산 단계 동안 10 분 동안 단일 세포 가장자리 돌출 역학을 측정합니다. 돌출 역학은 이러한 영화에서 kymographs를 생성하여 분석됩니다. 원칙적으로, 키모그래프는 시공간 플롯에서 움직이는 입자에 대한 상세한 정량적 데이터를 제공하여 세포 가장자리 역학에 대한 질적 이해를 제공합니다. 움직이는 파티클의 강도는 시간 대 공간 플롯의 모든 이미지 스택에 대해 플롯되며, 여기서 X축과 Y축은 각각 시간과 거리를 나타냅니다11. 이 방법은 ImageJ와 함께 수동 키모그래프 분석을 사용하여 상세한 정량적 데이터를 얻고, 낮은 신호 대 잡음비 및/또는 높은 피처 밀도의 경우 영화 및 이미지에서 정보를 검색하고, 위상차 광 현미경 또는 열악한 이미지 품질로 획득한 이미지를 분석할 수 있습니다.
본원에 기재된 세포-가장자리 돌출 역학 분석은 빠르고, 간단하고, 비용 효율적인 방법이다. 이와 같이, 그리고 세포 이동11,12과 직접적으로 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 더 많은 자원-요구되는 방법들을 수행하기로 결정하기 전에 세포 운동성에 관여하는 세포골격 역학을 시험하기 위한 예비 방법으로서 사용될 수 있다. 또한, 그것은 또한 세포 골격 단백질의 유전자 조작 (녹아웃, 녹다운 또는 구조 구조)이 간단한 플랫폼을 사용하여 세포 골격 역학에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 정량적 측정을 가능하게합니다. 이 분석은 세포 이동의 맥락에서 세포골격 역학을 탐구하기위한 유익한 모델이며 세포 운동성의 기초가되는 메커니즘과 분자의 해명에 사용될 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

다세포 유기체의 발달과 항상성은 세포 이동의 조정 된 조절에 의존합니다. 세포 이동은 조직의 구성 및 재생에 필수적인 사건이며 배아 발달, 면역 학적 반응 및 상처 치유에 중요합니다. 세포 운동성의 조절 장애는 만성 염증 및 암 전이와 같은 병리학 적 장애에 기여합니다. 세포 이동, 조직 침윤, 축삭 및 수상 돌기 성장은 모두 액틴 중합 매개 세포 가장자리 돌출부로 시작됩니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌출 역학의 이미징 및 정량 분석을위한 간단하고 효율적이며 시간을 절약하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 돌출부, 수축 및 주름과 같은 세포 가장자리 막 역학의 개별 특징을 측정하고 주요 액틴 조절기의 조작이 다양한 맥락에서 세포 가장자리 돌출부에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

도 2에 기술된 실험에서, 불멸화된 MEFs를 피브로넥틴으로 사전 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이팅하여 인테그린 매개 신호전달을 활성화시키고, 변성된 BSA에 의해 차단하여, 인테그린 활성화에 의존하지 않는 세포 부착을 위한 자유 전위 부위를 차단하였다. 실험 당일에 세포의 70%-80% 합류에서 대수 성장 단계에 도달하기 위해, 0.7 x 106 MEFs를 실험 16 h 전에 10 cm 직경?...

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Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

세포-가장자리 돌출 분석은 세포 이동과 직접적으로 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서 세포 운동성에 관여하는 중요한 단백질 및 신호전달 메카니즘을 확인하기 위한 예비 방법으로서 사용될 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하며 비용 효율적이며 형광 표지 또는 고가의 형광 현미경을 사용할 필요가 없습니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실의 학생 인 Michal Gendler가 될 것입니다. 유리 바닥 접시의 중앙에 하나의 일반 염산 용액 2 밀리리터를 넣고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오. PBS 두 밀리리터로 접시를 세 번 씻으십시오.PBS에서 밀리리터 당 10 마이크로그램의 농도로 피브로넥틴을 희석하고 희석된 용액 200 마이크로리터를 유리 중앙 접시에 첨가한다. 섭씨 37도에서 한 시간 동안 배양하십시오. 1%BSA 용액과 PBS를 준비하고 0.2마이크로미터 필터를 통과시킨다.용액을 미리 예온된 수조에서 섭씨 70도에서 30분 동안 인큐베이션하여 변성시킨다. 코팅 된 유리 바닥 접시를 PBS 두 밀리리터로 세 번 씻으십시오. 변성 BSA 용액 두 밀리리터를 넣고 한 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오.유리 접시를 PBS 두 밀리리터로 세 번 씻으십시오. 16 내지 18시간 전에 10 센티미터 직경의 조직 배양 플레이트 당 0.7 백만 개의 세포에서 실험하여 70 내지 80%컨플루언시를 달성하였다. 다음날, 두 밀리리터의 트립신 용액을 조직 배양 플레이트에 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 두세 분 동안 배양한다.트립신을 비활성화하기 위해 배지 다섯 밀리리터를 추가하십시오. 혈구측정기를 사용하여, 세포와 플레이트 20, 000 세포를 바닥 접시에서 완전한 배지의 2 밀리리터에 계수한다. 그 다음 플레이팅된 세포와 함께 접시를 15분 동안 인큐베이터에서 인큐베이션한다.이미징하기 한 시간 전에 가열 장치를 켜고 섭씨 37도에서 설정하십시오. 또한 이산화탄소 장치를 켜고 이미징 전에 5%10%로 설정합니다. 현미경과 카메라를 켭니다.컴퓨터를 켜고 현미경 수집 소프트웨어를 엽니다. 배율을 40X 드라이 렌즈 위상 대비로 설정합니다. 총 동영상 지속 시간을 10분으로 설정하고 시간 간격은 5초입니다.15 분 동안 배양 한 후, 부착 된 세포가있는 유리 바닥 접시를 어댑터에 넣고 고정하십시오. 접시가있는 어댑터를 현미경 단계의 슬롯에 삽입하십시오. 접시 덮개를 벗고 이산화탄소 뚜껑을 놓고 이산화탄소 밸브를 엽니 다.이미징에 적합한 셀을 찾습니다. 셀에 초점을 맞춘 후 동영상 수집을 시작합니다. 이미지 분석을 수행하려면 이미지 분석 소프트웨어에서 직선 도구를 선택하고 라멜라 및 셀 가장자리를 포함하여 45도마다 방사형 배열로 돌출부에 수직인 20개의 임의의 단위로 구성된 여덟 줄을 만듭니다.기본 도구 모음에서 이미지로 이동하여 스택을 선택한 다음 Reslice를 클릭하여 세포막 내의 단일 점의 이동을 설명하는 키모그래프 그림을 생성합니다. 키모그래프 이미지를 사용하여, 격자선으로 표시된 셀의 여덟 영역 각각에서 돌출부, 수축 및 주름의 수를 추출하고 수동으로 계수합니다. 이 숫자는 10 분 당 돌출부, 수축 및 주름의 빈도를 나타냅니다.돌출 지속성, 거리 및 속도를 kymography 분석으로 결정합니다. 돌출 거리를 결정하려면 돌출부의 바닥에서 돌출부의 가장 높은 피크까지 수직 선을 그립니다. M을 눌러 선의 길이를 픽셀 단위로 측정하고 픽셀 대 마이크로미터 비율이 길이를 마이크로미터 단위로 변환하는 것으로 알려져 있는지 확인합니다.돌출부, 반응 및 프릴의 정량화는 10분마다 수동으로 수행되었으며, 돌출부 및 굴절에 대해 얻어진 평균 빈도는 프릴의 경우 5.1 및 2.1이었다. 대표적인 키모그래프는 약 4.8마이크로미터의 돌출 거리와 약 0.6분의 돌출 시간을 가졌다. 분석에서 제외되어야 하는 셀의 예가 표현된다.kymography 분석은 세포가 확산 단계에 존재하지 않았으며 명확한 막 돌출부를 나타내지 않았다는 것을 밝혀 냈습니다. 가장 중요한 것은 이미징을 위해 올바른 세포를 선택하는 것입니다. 적절한 세포는 확산 단계에 있어야하며 세포 - 세포 통신 및 신호 전달을 피하기 위해 다른 세포를 만져서는 안됩니다.이 방법은 세포 이동 분석을 요구하는 더 많은 결과를 수행하기로 결정하기 전에 세포 운동성을 포함하는 세포 골격 역학을 테스트하기위한 예비 도구로 사용될 수 있습니다.

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