Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) e pela Fundação Israel Science (bolsas nº 1462/17 e 2142/21) (para Hava Gil-Henn).

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade bar-ilan.
NOTA: Uma representação gráfica passo a passo do procedimento descrito nesta seção aparece na Figura 1.
1. Cultura celular
NOTA: As células utilizadas no protocolo são fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) que foram gerados a par...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

A dinâmica de saliência de borda celular, composta por saliências, retrações e babados, é um pré-requisito e um evento potencial limitante de taxas na motilidade celular. Aqui descrevemos um método rápido e simples para medir a dinâmica das saliências de borda celular durante a disseminação. Este método permite imagens de curto prazo, gera uma quantidade significativa de dados, não requer rotulagem fluorescente de células ou equipamentos de microscopia fluorescente caros, e poderia ser usado como um méto...

A migração celular é um processo crítico que controla o desenvolvimento e a função de todos os organismos vivos. A migração celular ocorre em ambas as condições fisiológicas, como embriogênese, cicatrização de feridas e resposta imune, e em condições patológicas, como metástase do câncer e doença autoimune. Apesar das diferenças nos tipos celulares que participam de diferentes eventos migratórios, todos os eventos de motilidade celular compartilham mecanismos moleculares semelhantes, que foram conservados na evolução do protozoário aos mamíferos, e envolvem mecanismos comuns de controle citoesquelético que podem sentir o ambiente, responder a sinais e modular o comportamento celular em resposta1.
Um estágio inicial na migração celular pode ser a formação de saliências altamente dinâmicas na borda principal da célula. Por trás do lamellipodium pode-se encontrar a lamella, que casais atuam na contratelidade mediada por Myosin II e media a adesão ao substrato subjacente. Lamellipodia são induzidas por estímulos extracelulares, como fatores de crescimento, citocinas e receptores de adesão celular e são impulsionadas pela polimerização de actina, que fornece a força física que empurra a membrana plasmática para frente2,3. Muitas sinalizações e proteínas estruturais foram implicadas nisso; entre eles estão rho GTPases, que atuam coordenadamente com outros sinais para ativar proteínas reguladoras de actina, como o complexo Arp 2/3, proteínas familiares WASP e membros das famílias Formin e Spire em lamellipodia2,4,5.
Além da polimerização de actina, a atividade de miose II é necessária para a geração de forças contratuais no lamellipodium e na lamella anterior. Essas contrações, também definidas como retrações de borda celular, também podem resultar da despolimerização da actina dendrítica na periferia celular e são fundamentais para o desenvolvimento da borda principal lamellipodial e permitindo que a protrusão sinta a flexibilidade da matriz extracelular e outras células e determine a direção da migração6,7,8 . As saliências de borda celular que não podem ser anexadas ao substrato formarão babados de membrana periférica, estruturas semelhantes a folhas que aparecem na superfície ventral de lamellipodia e lamella e se movem para trás em relação à direção da migração. Como o lamellipodium não se prende ao substrato, um lamellipodium posterior se forma por baixo dele e empurra mecanicamente o primeiro lamellipodium em direção à superfície ventral superior. Os filamentos de actin no babado que antes eram paralelos ao substrato agora se tornam perpendiculares a ele, e o babado está agora posicionado acima do lamellipodium avançando. O babado que se move para trás cai de volta no citosol e representa um mecanismo celular para reciclagem de atolopodial em 9,10.
Aqui, descrevemos um ensaio para a medição da dinâmica de saliência de borda celular. O ensaio de saliência usa microscopia de vídeo de lapso de tempo para medir a dinâmica de saliência de borda única por 10 minutos durante a fase de disseminação da célula. A dinâmica da saliência é analisada gerando kymogramas a partir desses filmes. Em princípio, um kymograph transmite dados quantitativos detalhados de partículas móveis em uma trama esposteterna para produzir uma compreensão qualitativa da dinâmica das bordas celulares. A intensidade da partícula móvel é traçada para todas as pilhas de imagens em uma trama tempo versus espaço, onde o eixo X e o eixo Y representam tempo e distância, respectivamente11. Este método usa uma análise manual de kymógrafo com ImageJ para obter dados quantitativos detalhados, permitindo a recuperação de informações de filmes e imagens em caso de baixa relação sinal-ruído e/ou alta densidade de recursos, e a análise de imagens adquiridas em microscopia de luz de contraste de fase ou má qualidade da imagem.
O ensaio de saliência de borda celular descrito aqui é um método rápido, simples e econômico. Como tal, e porque tem sido mostrado correlacionar diretamente com a migração celular11,12, pode ser usado como um método preliminar para testar dinâmicas citoesqueletal envolvidas na motilidade celular antes de decidir realizar métodos mais exigentes de recursos. Além disso, também permite a medição quantitativa de como as manipulações genéticas (knockout, knockdown ou construtos de resgate) de proteínas citoesqueletal impactam a dinâmica citoesqueletal usando uma plataforma simples. O ensaio é um modelo instrutivo para explorar a dinâmica citoesquelético no contexto da migração celular e poderia ser usado para elucidação dos mecanismos e moléculas subjacentes à motilidade celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

O desenvolvimento e a homeostase dos organismos multicelulares dependem da regulação coordenada da migração celular. A migração celular é um evento essencial na construção e regeneração de tecidos, e é fundamental no desenvolvimento embrionário, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A desregulação da motilidade celular contribui para distúrbios patológicos, como inflamação crônica e metástase do câncer. Migração celular, invasão de tecido, axônio e dendrito superam tudo iniciado com saliências mediadas por células mediadas por actina. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e de economia de tempo para a imagem e análise quantitativa da dinâmica de saliência de borda celular durante a disseminação. Este método mede características discretas da dinâmica da membrana de borda celular, como saliências, retrações e babados, e pode ser usado para avaliar como as manipulações de principais reguladores de actina impactam as saliências de borda celular em diversos contextos.

No experimento descrito na Figura 2, MEFs imortalizados foram banhados em pratos de fundo de vidro pré-revestidos com fibronectina para ativar sinalização mediada por integrin, bloqueada pela BSA desnaturada, para bloquear locais potenciais livres para adesão celular que não depende da ativação do integrin. Para chegar à fase de crescimento logarítmico a 70%-80% de confluência de células no dia do experimento, 0,7 x 106 MEFs foram emplacados em uma placa de cultura teci...

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Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.

Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

O ensaio de saliência de borda celular mostrou-se diretamente correlacionado com a migração celular. Portanto, pode ser usado como um método preliminar para identificar proteínas críticas e mecanismos de sinalização envolvidos na motilidade celular. O método é rápido, simples, econômico e não requer rotulagem fluorescente ou uso de um microscópio fluorescente caro.Demonstrando o procedimento será Michal Gendler, um estudante do meu laboratório. Adicione dois mililitros de uma solução normal de ácido clorídrico no centro de uma placa de fundo de vidro e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave o prato três vezes com dois mililitros de PBS.Diluir a fibronectina a 10 microgramas por concentração de mililitros na PBS e adicionar 200 microliters da solução diluída ao prato central de vidro. Incubar por uma hora a 37 graus Celsius. Prepare a solução 1%BSA e a PBS e passe-a através de um filtro de 0,2 micrômetros.Desnaturar a solução incubando a 70 graus Celsius por 30 minutos em um banho de água pré-aquecido. Lave o prato de fundo de vidro revestido com dois mililitros de PBS três vezes. Adicione dois mililitros de solução BSA desnaturadas e incubar o prato a 37 graus Celsius por uma hora.Lave o prato de vidro com dois mililitros de PBS três vezes. Antes de 16 a 18 horas de experimento em 0,7 milhões de células por placa de cultura tecidual de 10 centímetros de diâmetro para alcançar 70 a 80% de confluência. No dia seguinte, adicione dois mililitros de solução de trippsina à placa de cultura tecidual e incubar por dois a três minutos até que as células se despeguem.Adicione cinco mililitros do meio para inativar a trippsina. Usando um hemacitómetro, conte as células e a placa 20.000 células em dois mililitros do meio completo em um prato inferior. Em seguida, incubar o prato com células banhadas em uma incubadora por 15 minutos.Ligue a unidade de aquecimento e coloque-a a 37 graus Celsius uma hora antes da imagem. Além disso, ligue a unidade de dióxido de carbono e coloque-a em 5%10 minutos antes da imagem. Ligue o microscópio e a câmera.Ligue o computador e abra o software de aquisição de microscópio. Coloque a ampliação em um contraste de fase de lente seca de 40X. Defina a duração total do filme para 10 minutos com um intervalo de tempo de cinco segundos.Após 15 minutos de incubação, coloque o prato de fundo de vidro com células aderidas em um adaptador e fixe-o. Insira o adaptador com o prato nas ranhuras no estágio do microscópio. Tire a tampa do prato, coloque a tampa de dióxido de carbono e abra a válvula de dióxido de carbono.Localize uma célula apropriada para imagens. Comece a aquisição de filmes depois de se concentrar no celular. Para realizar a análise da imagem, selecione a ferramenta reta no software de análise de imagens e faça oito linhas de 20 unidades arbitrárias perpendiculares às saliências em um arranjo radial a cada 45 graus, incluindo lamella e borda celular.Na barra de ferramentas principal, vá para a imagem, selecione Stacks e clique em Reslice para gerar uma imagem kymografia descrevendo o movimento de pontos únicos dentro da membrana celular. Utilizando as imagens de kymógrafo, extraia e contabiliza manualmente o número de saliências, retrações e babados em cada uma das oito regiões da célula marcada pelas linhas de grade. Esses números representam a frequência de saliências, retrações e babados por 10 minutos.Determine a persistência de saliência, distância e velocidade por meio da análise da kymografia. Para determinar a distância de saliência, retire a linha perpendicular da base da saliência até o pico mais alto da saliência. Pressione M para medir o comprimento da linha em pixels e certifique-se de que a relação pixel/micrômetro é conhecida por converter o comprimento em micrômetros.A quantificação de saliências, reações e babados foi realizada manualmente por 10 minutos e a frequência média obtida para saliências e retrações foi de 5,1 e 2,1 para babados. O kymograph representativo tinha uma distância de saliência de aproximadamente 4,8 micrômetros e um tempo de saliência de aproximadamente 0,6 minutos. Um exemplo de célula que deve ser excluída da análise é representado.A análise da kymografia revelou que a célula não estava presente em sua fase de disseminação e não apresentava nenhuma saliência de membrana clara. O mais importante é escolher células corretas para imagens. Uma célula adequada deve estar em sua fase de disseminação e não deve tocar outras células para evitar a comunicação e sinalização celular-célula.O método pode ser usado como uma ferramenta preliminar para testar a dinâmica citoesquelletal envolvendo motilidade celular antes de decidir realizar mais resultados exigindo ensaios de migração celular.

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