Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones NIH MH115939, NS112121, NS105640 y R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) y de la Fundación de Ciencias de Israel (subvenciones número 1462/17 y 2142/21) (a Hava Gil-Henn).

Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Bar-Ilan.
NOTA: En la figura 1 aparece una representación gráfica paso a paso del procedimiento descrito en esta sección.
1. Cultivo celular
NOTA: Las células utilizadas en el protocolo son fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) que se gene...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

La dinámica de protrusión del borde celular, compuesta de protuberancias, retracciones y volantes, es tanto un requisito previo como un evento potencial limitante de la velocidad en la motilidad celular. Aquí describimos un método rápido y simple para medir la dinámica de las protuberancias del borde celular durante la propagación. Este método permite obtener imágenes a corto plazo, genera una cantidad significativa de datos, no requiere el etiquetado fluorescente de las células o el costoso equipo de microscop...

La migración celular es un proceso crítico que controla el desarrollo y la función de todos los organismos vivos. La migración celular ocurre tanto en condiciones fisiológicas, como la embriogénesis, la cicatrización de heridas y la respuesta inmune, como en condiciones patológicas, como metástasis de cáncer y enfermedades autoinmunes. A pesar de las diferencias en los tipos de células que participan en diferentes eventos migratorios, todos los eventos de motilidad celular comparten mecanismos moleculares similares, que se han conservado en la evolución de los protozoos a los mamíferos, e involucran mecanismos comunes de control citoesquelético que pueden detectar el entorno, responder a las señales y modular el comportamiento celular en la respuesta1.
Una etapa inicial en la migración celular puede ser la formación de protuberancias altamente dinámicas en el borde delantero de la célula. Detrás del lamellipodium se puede encontrar la lámina, que acopla la actina a la contractilidad mediada por la miosina II y media la adhesión al sustrato subyacente. Los lamellipodia son inducidos por estímulos extracelulares como factores de crecimiento, citoquinas y receptores de adhesión celular y son impulsados por la polimerización de actina, que proporciona la fuerza física que empuja la membrana plasmática hacia adelante2,3. Muchas proteínas estructurales y de señalización han sido implicadas en esto; entre ellas se encuentran las Rho GTPasas, que actúan coordinadamente con otras señales para activar proteínas reguladoras de actina como el complejo Arp 2/3, las proteínas de la familia WASP y miembros de las familias Formin y Spire en lamellipodia2,4,5.
Además de la polimerización de actina, se requiere actividad de miosina II para generar fuerzas contráctiles en el lamelepodeio y la lámina anterior. Estas contracciones, también definidas como retracciones del borde celular, también pueden resultar de la despolimerización de la actina dendrítica en la periferia celular y son críticas para desarrollar el borde de ataque lamellipodial y permitir que la protuberancia detecte la flexibilidad de la matriz extracelular y otras células y determine la dirección de la migración6,7,8 . Las protuberancias del borde celular que no pueden unirse al sustrato formarán volantes de membrana periférica, estructuras en forma de lámina que aparecen en la superficie ventral de los lamellipodia y las láminas y se mueven hacia atrás en relación con la dirección de la migración. A medida que el lamellipodium no se adhiere al sustrato, se forma un lamellipodium posterior debajo de él y empuja mecánicamente el primer lamellipodium hacia la superficie ventral superior. Los filamentos de actina en el volante que antes eran paralelos al sustrato ahora se vuelven perpendiculares a él, y el volante ahora se coloca sobre el lamellipodium que avanza. El volante que se mueve hacia atrás cae de nuevo en el citosol y representa un mecanismo celular para reciclar la actina lamellipodial9,10.
Aquí, describimos un ensayo para la medición de la dinámica de protrusión del borde celular. El ensayo de protrusión utiliza microscopía de video de lapso de tiempo para medir la dinámica de protrusión de borde celular único durante 10 minutos durante la fase de propagación de la célula. La dinámica de protrusión se analiza generando kymographs a partir de estas películas. En principio, un kymograph imparte datos cuantitativos detallados de partículas en movimiento en una gráfica espaciotemporal para obtener una comprensión cualitativa de la dinámica del borde celular. La intensidad de la partícula en movimiento se traza para todas las pilas de imágenes en una gráfica de tiempo versus espacio, donde el eje X y el eje Y representan el tiempo y la distancia, respectivamente11. Este método utiliza un análisis manual de kymograph con ImageJ para obtener datos cuantitativos detallados, lo que permite recuperar información de películas e imágenes en caso de baja relación señal-ruido y / o alta densidad de características, y el análisis de imágenes adquiridas en microscopía de luz de contraste de fase o mala calidad de imagen.
El ensayo de dinámica de protrusión de borde celular descrito aquí es un método rápido, simple y rentable. Como tal, y debido a que se ha demostrado que se correlaciona directamente con la migración celular11,12, se puede utilizar como un método preliminar para probar la dinámica citoesquelética involucrada en la motilidad celular antes de decidir realizar métodos más exigentes en recursos. Además, también permite la medición cuantitativa de cómo las manipulaciones genéticas (knockout, knockdown o construcciones de rescate) de proteínas citoesqueléticas afectan la dinámica citoesquelética utilizando una plataforma sencilla. El ensayo es un modelo instructivo para explorar la dinámica citoesquelética en el contexto de la migración celular y podría usarse para dilucidar los mecanismos y moléculas subyacentes a la motilidad celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

El desarrollo y la homeostasis de los organismos multicelulares se basan en la regulación coordinada de la migración celular. La migración celular es un evento esencial en la construcción y regeneración de tejidos, y es fundamental en el desarrollo embrionario, las respuestas inmunológicas y la cicatrización de heridas. La desregulación de la motilidad celular contribuye a los trastornos patológicos, como la inflamación crónica y la metástasis del cáncer. La migración celular, la invasión tisular, el axón y el crecimiento de la dendrita se inician con protuberancias de borde celular mediadas por polimerización de actina. Aquí, describimos un método simple, eficiente y que ahorra tiempo para la obtención de imágenes y el análisis cuantitativo de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación. Este método mide las características discretas de la dinámica de la membrana del borde celular, como protuberancias, retracciones y volantes, y se puede utilizar para evaluar cómo las manipulaciones de los reguladores clave de actina afectan las protuberancias del borde celular en diversos contextos.

En el experimento descrito en la Figura 2, los MEF inmortalizados se enchaparon en platos con fondo de vidrio precubiertos con fibronectina para activar la señalización mediada por integrina, bloqueada por BSA desnaturalizada, para bloquear sitios potenciales libres para la adhesión celular que no depende de la activación de integrina. Para alcanzar la fase de crecimiento logarítmico al 70%-80% de confluencia de células el día del experimento, se colocaron 0,7 x 106 MEF en ...

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Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Este protocolo tiene como objetivo medir los parámetros dinámicos (protuberancias, retracciones, volantes) de las protuberancias en el borde de las células que se propagan.

Medición de la dinámica de protrusión del borde celular durante la propagación mediante microscopía de células vivas

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Se ha demostrado que el ensayo de protrusión del borde celular se correlaciona directamente con la migración celular. Por lo tanto, se puede utilizar como un método preliminar para identificar proteínas críticas y mecanismos de señalización involucrados en la motilidad celular. El método es rápido, simple, rentable y no requiere etiquetado fluorescente ni el uso de un costoso microscopio fluorescente.Demostrando el procedimiento estará Michal Gendler, un estudiante de mi laboratorio. Agregue dos mililitros de una solución normal de ácido clorhídrico en el centro de un plato con fondo de vidrio e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS.Diluya la fibronectina a 10 microgramos por mililitro de concentración en PBS y agregue 200 microlitros de la solución diluida al plato central de vidrio. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Prepare la solución 1% BSA y PBS y páselo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.Desnaturalizar la solución incubando a 70 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua precalentada. Lave el plato con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS tres veces. Agregue dos mililitros de solución de BSA desnaturalizada e incube el plato a 37 grados centígrados durante una hora.Lave el plato de vidrio con dos mililitros de PBS tres veces. Antes de 16 a 18 horas de experimento a 0,7 millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros de diámetro para lograr una confluencia del 70 al 80%. Al día siguiente, agregue dos mililitros de solución de tripsina a la placa de cultivo de tejido e incube durante dos o tres minutos hasta que las células se separen.Agregue cinco mililitros del medio para inactivar la tripsina. Usando un hemaciómetro, cuente las celdas y la placa 20, 000 celdas en dos mililitros del medio completo en un plato inferior. Luego incube el plato con células chapadas en una incubadora durante 15 minutos.Encienda la unidad de calefacción y configúrela a 37 grados centígrados una hora antes de la toma de imágenes. Además, encienda la unidad de dióxido de carbono y configúrela al 5% 10 minutos antes de la toma de imágenes. Encienda el microscopio y la cámara.Encienda la computadora y abra el software de adquisición del microscopio. Ajuste el aumento en un contraste de fase de lente seca de 40X. Establezca la duración total de la película en 10 minutos con un intervalo de tiempo de cinco segundos.Después de 15 minutos de incubación, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en un adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en las ranuras de la etapa del microscopio. Retire la tapa del plato, coloque la tapa de dióxido de carbono y abra la válvula de dióxido de carbono.Localice una célula apropiada para la obtención de imágenes. Comience la adquisición de películas después de centrarse en la célula. Para realizar el análisis de imagen, seleccione la herramienta recta en el software de análisis de imágenes y haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias perpendiculares a las protuberancias en una disposición radial a cada 45 grados, incluyendo láminas y bordes celulares.En la barra de herramientas principal, vaya a la imagen, seleccione Pilas y luego haga clic en Reslice para generar una imagen de kymograph que describa el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular. Utilizando las imágenes del kymograph, extraiga y cuente manualmente el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda marcada por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 minutos.Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para determinar la distancia de protuberancia, dibuje una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M para medir la longitud de la línea en píxeles y asegúrese de que se sepa que la relación píxel-micrómetro convierte la longitud en micrómetros.La cuantificación de protuberancias, reacciones y volantes se realizó manualmente por 10 minutos y la frecuencia promedio obtenida para protuberancias y retracciones fue de 5,1 y 2,1 para volantes. El kymograph representativo tenía una distancia de protuberancia de aproximadamente 4,8 micrómetros y un tiempo de protuberancia de aproximadamente 0,6 minutos. Se representa un ejemplo de una celda que debe excluirse del análisis.El análisis de la gammagrafía reveló que la célula no estaba presente en su fase de propagación y no mostró ninguna protuberancia clara de la membrana. Lo más importante es elegir las células correctas para la obtención de imágenes. Una célula adecuada debe estar en su fase de propagación y no debe tocar otras células para evitar la comunicación y señalización célula-célula.El método se puede utilizar como una herramienta preliminar para probar la dinámica citoesquelética que involucra la motilidad celular antes de decidir realizar más resultados que exijan ensayos de migración celular.

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