Name: measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy
Uploaded: 2021-11-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Bu çalışma NIH MH115939, NS112121, NS105640 ve R56MH122449-01A1 (Anthony J. Koleske'ye) ve İsrail Bilim Vakfı'ndan (1462/17 ve 2142/21 numaralı hibeler) (Hava Gil-Henn'e) hibelerle desteklenmiştir.

Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler, Bar-Ilan Üniversitesi kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu bölümde açıklanan yordamın adım adım grafiksel gösterimi Şekil 1'de görülmektedir.
1. Hücre kültürü
NOT: Protokolde kullanılan hücreler, vahşi tip C57BL / 6 farelerin E11.5-13.5 embriyolarından üretilen fare embriyonik f...

<ol>
	<li>Kurosaka, S., Kashina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology+of+embryonic+migration.">Cell biology of embryonic migration.</a> Birth Defects Research Part C - Embryo Today: Reviews. 84 (2), 102-122 (2008).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li><li>Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+distinct+actin+networks+drive+the+protrusion+of+migrating+cells.">Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells.</a> Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).</li><li>Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unleashing+formins+to+remodel+the+actin+and+microtubule+cytoskeletons.">Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).</li><li>Chesarone, M. A., Goode, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+nucleation+and+elongation+factors:+mechanisms+and+interplay.">Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).</li><li>Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , (2013).</li><li>Giannone, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellipodial+actin+mechanically+links+myosin+activity+with+adhesion-site+formation.">Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation.</a> Cell. 128 (3), 561-575 (2007).</li><li>Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+stress+fibers--assembly,+dynamics+and+biological+roles.">Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles.</a> Journal of Cell Science. 125, 1855-1864 (2012).</li><li>Wilson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+II+contributes+to+cell-scale+actin+network+treadmilling+through+network+disassembly.">Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly.</a> Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).</li><li>Chhabra, E. S., Higgs, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+faces+of+actin:+matching+assembly+factors+with+cellular+structures.">The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures.</a> Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).</li><li>Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+lamella+dynamics+of+cultured+cells+by+SACED,+a+new+computer-assisted+motion+analysis.">Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis.</a> Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).</li><li>Bear, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+between+Ena/VASP+proteins+and+actin+filament+capping+regulates+fibroblast+motility.">Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility.</a> Cell. 109 (4), 509-521 (2002).</li><li>Doggett, T. M., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+actin+cytoskeleton+in+live+endothelial+cells+expressing+GFP-actin.">Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).</li><li>Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Abl-related+gene+(Arg)+requires+its+F-actin-microtubule+cross-linking+activity+to+regulate+lamellipodial+dynamics+during+fibroblast+adhesion.">The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion.</a> Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).</li><li>Bryce, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortactin+promotes+cell+motility+by+enhancing+lamellipodial+persistence.">Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence.</a> Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).</li><li>Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arg+interacts+with+cortactin+to+promote+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion.">Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion.</a> Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).</li><li>Miller, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+actin+polymerization+and+adhesion-dependent+cell+edge+protrusion+by+the+Abl-related+gene+(Arg)+tyrosine+kinase+and+N-WASp.">Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp.</a> Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).</li><li>Lukic, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyk2+regulates+cell-edge+protrusion+dynamics+by+interacting+with+Crk.">Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2021).</li></ol>

Çıkıntılar, retraksiyonlar ve fırfırlardan oluşan hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinde hem bir ön koşul hem de potansiyel bir hız sınırlayıcı olaydır. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntılarının dinamiklerini ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kısa süreli görüntülemeyi mümkün kılar, önemli miktarda veri üretir, hücrelerin floresan etiketlemesini veya pahalı floresan mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve daha fazl...

Hücre göçü, tüm canlı organizmaların gelişimini ve işlevini kontrol eden kritik bir süreçtir. Hücre göçü hem embriyogenez, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi gibi fizyolojik durumlarda hem de kanser metastazı ve otoimmün hastalık gibi patolojik durumlarda ortaya çıkar. Farklı göç olaylarında yer alan hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen, tüm hücre hareketlilik olayları, protozoalardan memelilere evrimde korunmuş olan benzer moleküler mekanizmaları paylaşır ve çevreyi algılayabilen, sinyallere yanıt verebilen ve yanıt olarak hücre davranışını modüle edebilen ortak hücre iskeleti kontrol mekanizmalarını içerir1.
Hücre göçünde ilk aşama, hücrenin ön kenarında oldukça dinamik çıkıntıların oluşumu olabilir. Lamellipodyumun arkasında, aktin'i miyozin II aracılı kontraktiliteye bağlayan ve altta yatan substrata yapışmaya aracılık eden lamel bulunabilir. Lamellipodia, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre adezyon reseptörleri gibi hücre dışı uyaranlar tarafından indüklenir ve plazma zarını ileriye doğru iten fiziksel kuvveti sağlayan aktin polimerizasyonu tarafından tahrik edilir2,3. Birçok sinyal ve yapısal protein buna dahil edilmiştir; Bunlar arasında, Arp 2/3 kompleksi, WASP ailesi proteinleri ve lamellipodia2,4,5'teki Formin ve Spire ailelerinin üyeleri gibi aktin düzenleyici proteinleri aktive etmek için diğer sinyallerle koordineli olarak hareket eden Rho GTPazlar bulunmaktadır.
Aktin polimerizasyonuna ek olarak, lamellipodyum ve anterior lamelde kontraktil kuvvetler üretmek için miyozin II aktivitesi gereklidir. Hücre kenarı retraksiyonları olarak da tanımlanan bu kasılmalar, hücre periferinde dendritik aktinin depolimerizasyonundan da kaynaklanabilir ve lamellipodial ön kenarı geliştirmek ve çıkıntının hücre dışı matrisin ve diğer hücrelerin esnekliğini algılamasına ve göç yönünü belirlemesine izin vermek için kritik öneme sahiptir6,7,8 . Substrata yapışamayan hücre kenarı çıkıntıları, periferik membran fırfırları, lamellipodia ve lamelin ventral yüzeyinde görünen tabaka benzeri yapılar oluşturacak ve göç yönüne göre geriye doğru hareket edecektir. Lamellipodyum substrata yapışamadığından, altında bir posterior lamellipodyum oluşur ve ilk lamellipodyumu mekanik olarak üst ventral yüzeye doğru iter. Daha önce substrata paralel olan fırfırdaki aktin filamentleri şimdi ona dik hale gelir ve fırfır şimdi ilerleyen lamellipodyumun üzerine yerleştirilir. Geriye doğru hareket eden fırfır, sitosol içine geri düşer ve lamellipodial aktinin geri dönüşümü için hücresel bir mekanizmayı temsil eder9,10.
Burada, hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümü için bir tahlil açıklıyoruz. Çıkıntı testi, hücrenin yayılma aşamasında 10 dakika boyunca tek hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini ölçmek için hızlandırılmış video mikroskopisi kullanır. Çıkıntı dinamikleri, bu filmlerden kimografiler üretilerek analiz edilir. Prensip olarak, bir kimograf, hücre kenarı dinamiklerinin nitel bir anlayışını sağlamak için uzaysal zamansal bir grafikte hareketli parçacıkların ayrıntılı nicel verilerini verir. Hareketli parçacığın yoğunluğu, X ekseni ve Y ekseninin sırasıyla zaman ve mesafeyi temsil ettiği bir zamana karşı uzay grafiğindeki tüm görüntü yığınları için çizilir11. Bu yöntem, ayrıntılı nicel veriler elde etmek için ImageJ ile manuel bir kimograf analizi kullanır, düşük sinyal-gürültü oranı ve / veya yüksek özellik yoğunluğu durumunda filmlerden ve görüntülerden bilgi alınmasını ve faz kontrastlı ışık mikroskobu veya düşük görüntü kalitesinde elde edilen görüntülerin analizini sağlar.
Burada açıklanan hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi hızlı, basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle ve hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterildiğinden11,12, daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Ayrıca, sitoiskelet proteinlerinin genetik manipülasyonlarının (nakavt, nakavt veya kurtarma yapıları) basit bir platform kullanarak sitoiskelet dinamiklerini nasıl etkilediğinin nicel ölçümünü de sağlar. Tahlil, hücre göçü bağlamında sitoiskelet dinamiklerini araştırmak için öğretici bir modeldir ve hücre hareketliliğinin altında yatan mekanizmaların ve moleküllerin aydınlatılması için kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>P7612-360EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (1xDPBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td>Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS-AF Leica Application Suite 3.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica AF6000</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin solution</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)</td>
			<td>Biological Industries, Israel</td>
			<td>03-052-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring cell-edge protrusion dynamics during spreading using live-cell microscopy

Çok hücreli organizmaların gelişimi ve homeostazı, hücre göçünün koordineli bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Hücre göçü, dokuların yapımında ve yenilenmesinde önemli bir olaydır ve embriyonik gelişimde, immünolojik yanıtlarda ve yara iyileşmesinde kritik öneme sahiptir. Hücre hareketliliğinin düzensizliği, kronik inflamasyon ve kanser metastazı gibi patolojik bozukluklara katkıda bulunur. Hücre göçü, doku invazyonu, akson ve dendrit büyümesi, aktin polimerizasyonu aracılı hücre kenarı çıkıntıları ile başlar. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin görüntülenmesi ve kantitatif analizi için basit, verimli, zaman kazandıran bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar gibi hücre kenarı membran dinamiklerinin ayrık özelliklerini ölçer ve anahtar aktin düzenleyicilerinin manipülasyonlarının çeşitli bağlamlarda hücre kenarı çıkıntılarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Şekil 2'de açıklanan deneyde, ölümsüzleştirilmiş MEF'ler, integrin aktivasyonuna bağlı olmayan hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek için denatüre BSA tarafından bloke edilen integrin aracılı sinyallemeyi aktive etmek için fibronektin ile önceden kaplanmış cam tabanlı tabaklar üzerine kaplanmıştır. Deney günü hücrelerin %70-%80 birleşmesinde logaritmik büyüme evresine ulaşmak için, deneyden 16 saat önce 10 cm çapında bir doku k...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy at JoVE.com

Measuring Cell-Edge Protrusion Dynamics during Spreading using Live-Cell Microscopy

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

The development and homeostasis of multicellular organisms rely on coordinated regulation of cell migration. Cell migration is an essential event in the ...

Hücre kenarı çıkıntı testinin hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, hücre hareketliliğinde rol oynayan kritik proteinleri ve sinyal mekanizmalarını tanımlamak için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Yöntem hızlı, basit, uygun maliyetlidir ve floresan etiketleme veya pahalı bir floresan mikroskobu kullanma gerektirmez.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan bir öğrenci olan Michal Gendler olacak. Bir cam alt kabın ortasına iki mililitre normal hidroklorik asit çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bulaşığı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın.PBS'de mililitre konsantrasyon başına 10 mikrogramda fibronektini seyreltin ve cam merkez kabına 200 mikrolitre seyreltilmiş çözelti ekleyin. 37 santigrat derecede bir saat boyunca kuluçkaya yatırın. %1 BSA çözeltisi ve PBS hazırlayın ve 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin.Önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 santigrat derecede inkübe ederek çözeltiyi denatüre edin. Kaplamalı cam alt kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İki mililitre denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve çanağı bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Cam kabı iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. 10 santimetre çapında doku kültürü plakası başına 0,7 milyon hücrede 16 ila 18 saatlik deneyden önce% 70 ila% 80 akıcılık elde etmek için. Ertesi gün, doku kültürü plakasına iki mililitre tripsin çözeltisi ekleyin ve hücreler ayrılana kadar iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın.Tripsini inaktive etmek için ortamın beş mililitresini ekleyin. Bir hemasitometre kullanarak, hücreleri sayın ve bir alt tabaktaki tam ortamın iki mililitresinde 20.000 hücreyi tabaklayın. Daha sonra çanağı 15 dakika boyunca bir inkübatörde kaplanmış hücrelerle inkübe edin.Isıtma ünitesini açın ve görüntülemeden bir saat önce 37 santigrat dereceye ayarlayın. Ayrıca, karbondioksit ünitesini açın ve görüntülemeden 10 dakika önce% 5'e ayarlayın. Mikroskop ve kamerayı açın.Bilgisayarı açın ve mikroskop edinme yazılımını açın. Büyütmeyi 40X kuru lens faz kontrastına ayarlayın. Toplam film süresini beş saniyelik bir zaman aralığıyla 10 dakika olarak ayarlayın.15 dakikalık inkübasyondan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam alt kabı bir adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvalara yerleştirin. Çanak kapağını çıkarın, karbondioksit kapağını yerleştirin ve karbondioksit valfini açın.Görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücreye odaklandıktan sonra film edinimine başlayın. Görüntü analizini gerçekleştirmek için, görüntü analiz yazılımında düz aracı seçin ve lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere her 45 derecede radyal bir düzenlemede çıkıntılara dik 20 rastgele birimden oluşan sekiz satır yapın.Ana araç çubuğunda görüntüye gidin, Yığınlar'ı seçin ve ardından hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini açıklayan bir kimograf resmi oluşturmak için Reslice'a tıklayın. Kimograf görüntülerini kullanarak, ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar, 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder.Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirler. Çıkıntı mesafesini belirlemek için, çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek ve piksel-mikrometre oranının uzunluğu mikrometre cinsinden dönüştürdüğünün bilindiğinden emin olmak için M tuşuna basın.Çıkıntılar, reaksiyonlar ve fırfırlar 10 dakikada manuel olarak yapıldı ve çıkıntılar ve retraksiyonlar için elde edilen ortalama sıklık fırfırlar için 5.1 ve 2.1 idi. Temsili kimograf, yaklaşık 4.8 mikrometrelik bir çıkıntı mesafesine ve yaklaşık 0.6 dakikalık bir çıkıntı süresine sahipti. Analizin dışında bırakılması gereken bir hücre örneği temsil edilir.Kimografi analizi, hücrenin yayılma evresinde bulunmadığını ve net bir zar çıkıntısı göstermediğini ortaya koydu. En önemli şey, görüntüleme için doğru hücreleri seçmektir. Uygun bir hücre yayılma aşamasında olmalı ve hücre-hücre iletişimi ve sinyallemesini önlemek için diğer hücrelere dokunmamalıdır.Yöntem, hücre migrasyon tahlilleri gerektiren daha fazla sonuç almaya karar vermeden önce hücre hareketliliğini içeren sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön araç olarak kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Biyoloji

Live Cell Response to Mechanical Stimulation Studied by Integrated Optical and Atomic Force Microscopy

Tümleşik Optik ve Atomik Kuvvet Mikroskobu eğitimi Mekanik Uyarım Canlı Hücre Tepki

To understand the mechanism by which living cells sense mechanical forces, and how they respond and adapt to their environment, a new technology able to ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Live Cell Imaging of Primary Rat Neonatal Cardiomyocytes Following Adenoviral and Lentiviral Transduction Using Confocal Spinning Disk Microscopy

İlköğretim Rat Yenidoğan kardiyomiyositlerin Canlı Hücre Görüntüleme Adenoviral izlenerek ve Lentiviral İletimi Confocal Disk Mikroskopi Spinning kullanma

Primary rat neonatal cardiomyocytes are useful in basic in vitro cardiovascular research because they can be easily isolated in large numbers in a single ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

sertliği ölçme<em&gt; Ex Vivo</emAtomik Kuvvet Mikroskobu Kullanma&gt; Fare aorta

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Live Cell Imaging and 3D Analysis of Angiotensin Receptor Type 1a Trafficking in Transfected Human Embryonic Kidney Cells Using Confocal Microscopy

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Live-cell imaging is used to simultaneously capture time-lapse images of angiotensin type 1a receptors (AT1aR) and intracellular compartments in ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Temel işlemler sırasında mikrobiyal hücre büyümesini gözlemlemek için hücre Floresans mikroskobu canlı

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Zararlı etkileri, düşük basınç plazma sterilizasyon Bacillus subtilis sporlar kullanarak canlı cep mikroskobu sağkalıma soruşturma

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

Çıkıntı kuvvet mikroskobu: Hücre çıkıntılar tarafından geliştirilen kuvvetleri ölçmek için bir yöntem

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Exploiting Live Imaging to Track Nuclei During Myoblast Differentiation and Fusion

Parça çekirdeği canlı görüntüleme sırasında Myoblast farklılaşma ve füzyon istismar

Nuclear positioning within cells is important for multiple cellular processes in development and regeneration. The most intriguing example of nuclear ...