Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
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この技術の開発に貢献したLBHの過去と現在の研究室のメンバーに感謝します。このラボは、NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB)、NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB)、NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH) によってサポートされています。図2は、Biorenderソフトウェアを使用して描画されました。

このプロトコルは、ベイラー医科大学のヒト研究倫理委員会のヒトサンプルの操作に関するガイドラインに従っています。血液サンプルは、ヒトサンプルの機関安全ガイドラインに従って取り扱われます。血液サンプルは地域の血液バンクで得られ、そこでクエン酸リン酸デキストロース(CPD)溶液で収集されます。しかしながら、ヘパリンナトリウム、リチウムヘパリン、またはEDTAのような?...

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このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単離された単球からマクロファージを得るワークフローと、細胞の生存率および挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼBiFCレポーターをヒトMDMに効率的に導入する方法を記述している。
このプロトコルは、BiFC技術35 を利用して、カスパーゼリクルートメントドメイン(CARD)における炎症性カスパーゼを、分割蛍...

カスパーゼは、システインアスパラギン酸プロテアーゼのファミリーであり、イニシエーターカスパーゼおよび死刑執行人カスパーゼにグループ化することができる。死刑執行人カスパーゼは、カスパーゼ-3、-6および-7を含む。それらは二量体として細胞内に自然に見出され、アポトーシス1を実行するために開始カスパーゼによって切断される。開始カスパーゼには、ヒトカスパーゼ−1、−2、−4、−5、−8、−9、−10および−12が含まれる。それらは、近接誘導二量体化によって活性化され、自己タンパク質分解切断によって安定化される不活性ザイモゲン(プロカスパーゼ)として見出される2,3。炎症性カスパーゼは、開始カスパーゼ2のサブセットであり、ヒトにおけるカスパーゼ−1、−4、−5、および−12、ならびにマウス4、5におけるカスパーゼ−1、−11、および−12を包含する。アポトーシスの役割ではなく、炎症において中心的な役割を果たします。それらは、病原性侵入者8,9に応答して放出される最初のサイトカインであるプロインターロイキン(IL)−1βおよびプロIL−18 6,7のタンパク質分解的プロセシングおよび分泌を媒介する。カスパーゼ-1は、その活性化プラットフォームへの募集時に活性化される。インフラマソームと呼ばれる大きな分子量のタンパク質複合体(図1A)10。カスパーゼ−4、−5、および−11の二量体化は、非正準インフラマソーム経路11、12を介してこれらのプラットフォームとは独立して起こる。
正準インフラマソームは、インフラマソームセンサータンパク質、アダプタータンパク質ASC(CARDを含むアポトーシス関連スペック様タンパク質)、およびエフェクタータンパク質カスパーゼ-110からなる細胞質ゾル多量体タンパク質複合体である。最もよく研究された正準インフラマソームは、ピリンドメイン(NLRP)、NLRP1およびNLRP3を含むNOD様受容体ファミリー、CARD(NLRC)、NLRC4を含むNLRファミリー、および黒色腫2に存在しない(AIM2)である。それらはそれぞれ、ピリンドメイン、CARD、またはその両方のドメインを含む。CARD ドメインは、CARD を含むカスパーゼとそのアップストリーム アクティベーター間の相互作用を仲介します。したがって、N末端ピリンドメイン(PYD)とC末端CARDモチーフ13,14とからなる足場分子ASCは、NLRP110、NLRP3 15、およびAIM216インフラマソームへのカスパーゼ-1のリクルートに必要である。
各インフラマソームは、明確な炎症促進性刺激を認識する独自のセンサータンパク質にちなんで名付けられました(図1B)。この経路の活性化因子は、正準刺激と呼ばれる。インフラマソームは、微生物成分および組織ストレスのセンサとして機能し、炎症性カスパーゼ17の活性化を介して堅牢な炎症反応を誘発するように組み立てられる。インフラマソームアセンブリは、カスパーゼ−1活性化を開始し、その主要基質であるプロ−IL−1βおよびプロIL−18の成熟および分泌を媒介する。このプロセスは、2段階のメカニズムを介して行われます。第1に、プライミング刺激は、NF−κB経路の活性化を介して、ある種のインフラマソームタンパク質およびプロIL−1βの発現をアップレギュレートする。第二に、細胞内(正準)刺激は、プロカスパーゼ-1 6,7のインフラマソーム集合および動員を誘導する。
カスパーゼ−4およびカスパーゼ−5は、マウスカスパーゼ−11 11のヒトオルソログである。それらは、グラム陰性菌18、19、20の外膜に見られる分子である細胞内リポ多糖(LPS)および赤血球溶血21の産物である細胞外ヘムによって、インフラマソーム非依存的に活性化される。LPSがこれらのタンパク質のCARDモチーフに直接結合し、それらのオリゴマー化を誘導することが提案されている20。カスパーゼ-4またはカスパーゼ-5の活性化は、孔形成タンパク質ガスデルミンD(GSDMD)の切断を介してピロトーシスと呼ばれる炎症型の細胞死を誘導することによってIL-1β放出を促進する18,19。さらに、カスパーゼ−4およびGSDMD媒介性パイロプトーシス死から生じるカリウムイオンの流出は、NLRP3インフラマソームの活性化およびその後のカスパーゼ−1の活性化を誘導する22,23。したがって、カスパーゼ−4、−5、および−11は、特定の刺激に応答してパイロプトーシスおよびカスパーゼ−1活性化を誘導することができるLPSの細胞内センサと考えられる11、24。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> 図1:炎症性カスパーゼおよびカスパーゼ-二分子蛍光相補(BiFC)アッセイ。(A)カスパーゼ-BiFC系を示す図では、金星の各非蛍光断片(Venus-CまたはVenus-N)に連結された2つのカスパーゼ-1プロドメイン(C1-pro)がNLRP3活性化プラットフォームにリクルートされ、金星にリフォールドと蛍光が強制されます。この複合体は、顕微鏡下で緑色の斑点として現れ、開始カスパーゼ活性化の最初のステップである炎症性カスパーゼ誘発近接の読み出しとして機能する。(b)インフラマソーム成分および炎症性カスパーゼのドメイン組織を示す模式図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
特定の開始剤カスパーゼ活性化を測定することは困難であり、イメージングアプローチによってこれを行うために利用可能な方法は多くない。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を直接可視化するために使用できます(図1A)25。この技術は、最近、ヒト単球由来マクロファージ(MDM)21における使用に適応されている。カスパーゼBiFCは、炎症性カスパーゼ活性化における第1ステップを測定し、二量体化を促進するために近接を誘導する。CARD含有カスパーゼプロドメインをコードするプラスミドの発現は、光線上黄色蛍光タンパク質Venusの非蛍光断片に融合(Venus−C[VC])およびVenus−N[VN])が使用される。2つのカスパーゼプロドメインが活性化プラットフォームにリクルートされるか、または誘導された近接を受けると、金星の2つの半分が近接し、リフォールドおよび蛍光を発することを余儀なくされる( 図1A、B参照)。これは、特定の炎症性カスパーゼ活性化のリアルタイム読み出しを提供する。
ヒトMDMは、危険シグナルや病原体産物を同定するインフラマソーム遺伝子やパターン認識受容体を豊富に発現しています。これは、炎症性カスパーゼ経路の尋問に理想的な細胞型を提供する。さらに、それらは末梢血から、さらには患者サンプルから誘導して、特定の疾患状態における炎症性カスパーゼ活性化を評価することができる。このプロトコルでは、ヌクレオフェクションを使用してBiFCカスパーゼレポーターをMDMに導入する方法、エレクトロポレーションベースのトランスフェクション法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および顕微鏡アプローチを使用して活性カスパーゼ複合体を視覚化する方法について説明しています。さらに、この方法論は、これらの複合体の分子組成、細胞内局在化、動態、およびこれらの高度に秩序付けられた構造のサイズを決定するために適合させることができる25、26、27。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

炎症性カスパーゼは、カスパーゼ−1、−4、−5、−11、および−12を含み、開始カスパーゼのサブグループに属する。カスパーゼ-1は、炎症シグナル伝達の正しい調節を確実にするために必要であり、インフラマソームへの動員に続く近接誘導二量体化によって活性化される。カスパーゼ-1は単球系細胞系譜に豊富であり、炎症誘発性サイトカインインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18の成熟を活性分泌分子に誘導する。他の炎症性カスパーゼでは、カスパーゼ−4および−5(ならびにそれらのマウスホモログカスパーゼ−11)は、ピロトーシスを誘導することによってIL−1β放出を促進する。カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)は、カスパーゼ活性化の読み出しとして炎症性カスパーゼ誘導近接を測定するために使用されるツールです。インフラマソームに結合する領域を含むカスパーゼ-1、-4、または-5プロドメインは、黄色蛍光タンパク質Venus(Venus-N [VN]またはVenus-C [VC])の非蛍光断片に融合され、カスパーゼが誘導近接したときに蛍光金星複合体を改質する。このプロトコルは、ヌクレオフェクションを使用してこれらのレポーターを初代ヒト単球由来マクロファージ(MDM)に導入する方法、炎症性カスパーゼ活性化を誘導するために細胞を治療する方法、および蛍光および共焦点顕微鏡を用いてカスパーゼ活性化を測定する方法を記述している。このアプローチの利点は、生細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。しかし、細胞の生存率と挙動を損なわないように、慎重な制御を考慮する必要があります。この技術は、インフラマソームレベルでの動的カスパーゼ相互作用の分析、ならびにヒト血液サンプル由来の生きたMDMおよび単球における炎症シグナル伝達カスケードの尋問のための強力なツールである。

選択されたCD14+単球をGM-CSFと共に7日間インキュベートした後、細胞形態は分化期間の過程で変化し(図3A)、球状浮遊細胞からスピン状および完全に付着する(3日目および4日目)まで、 そして最後に、完全に分化したときに細胞をより広げる(7日目)。次いで、完全に分化した細胞をプレートから剥離し、カスパーゼBiFC対(VCおよびVN)をレポータープラス...

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Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

このプロトコルは、ヒト血液サンプルから単球由来マクロファージ(MDM)を取得するワークフロー、細胞の生存率と挙動を損なうことなく炎症性カスパーゼ二分子蛍光相補(BiFC)レポーターをヒトMDMに効率的に導入する簡単な方法、および生細胞における炎症性カスパーゼ活性化を測定するためのイメージングベースのアプローチを記述しています。

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

このプロトコルは、特定の疾患状態の生細胞における炎症性カスパーゼ経路を分子レベルで視覚化および尋問するために使用することができるため、重要である。この技術の主な利点は、初代免疫細胞における炎症性カスパーゼ活性化複合体の成分、要件、および局在を同定するために使用することができることである。わずかな最適化により、この方法は、他の初代細胞およびオリゴマー化によって活性化された一連のタンパク質に適合させることができ、その適用可能性は顕微鏡的方法論に限定されない。まず、完全に分化したマクロファージから10センチメートルの皿に培地を吸引し、温かい無血清RPMI-1640培地で細胞単層を洗浄し、すべての培地を完全に除去する。10センチメートルディッシュあたり2ミリリットルの0.25%温かいトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞を回収する。トリプシン−EDTAをP−1000マイクロピペットでディッシュ全体に上下に穏やかにピペットし、次いで懸濁液を5ミリリットルの温かい完全培養培地を含む15ミリリットルの円錐形チューブに移す。明視野顕微鏡下で細胞の剥離を確認し、必要に応じて再度剥離する。培地を吸引し、摂氏37度に予め加温した10ミリリットルの1倍滅菌PBSに細胞を再懸濁する。その後、20マイクロリットルのアリコートを取り、血球計数器を用いて細胞数を決定した。トランスフェクションごとに 10 ~ 5 番目の細胞を 1 ~ 2 回取り、15 ミリリットルのチューブに入れます。予め加温した1X滅菌PBSで15ミリリットルの最終容量にする。PBSを吸引し、250 x gで1分間もう一度遠心分離します。P-200マイクロピペットを用いて細胞ペレットから残留PBSを除去する。トランスフェクションごとに 1.5 ミリリットルの滅菌マイクロチューブを取り、適切なレポータープラスミドとカスパーゼ BiFC プラスミドをフードに加えます。ピペットステーション、装置、チップ、エレクトロポレーションチューブ、およびピペットを滅菌層流フード内に置く。ヌクレオフェクション装置を接続して電源を入れます。表示された起動画面に断面パラメータを入力します。電圧を押し、1000と入力し、Doneを押して1000ボルトに設定します。「幅」を押し、「40」と入力し、「完了」を押してパルスを 40 ミリ秒に設定します。最後に、パルスを押し、2と入力し、完了を押して電気パルスの数を2に設定します。エレクトロポレーションチューブの1つを取り、室温で3ミリリットルの電解バッファーEで満たします。エレクトロポレーションチューブをピペットステーションのピペットホルダーに挿入し、チューブ側面の電極が内側を向いており、チューブを挿入するとカチッという音が聞こえることを確認します。細胞ペレットを取り、5番目の細胞にそれぞれ1〜2回ずつ10〜2回ずつ10マイクロリットルの予め加温した再懸濁R緩衝液を加え、P−20マイクロピペットで穏やかに混合する。10マイクロリットルの細胞懸濁液を各トランスフェクションチューブに加え、P-20マイクロピペットで穏やかに混合する。プッシュボタンを2番目のストップに押してチップをピペットに挿入し、クランプが先端のピストンの取り付けステムを完全に持ち上げていることを確認します。次に、ピペットのプッシュボタンを押して最初の停止し、細胞またはプラスミドDNA混合物を含む第1のチューブに浸漬してサンプルを吸引します。サンプルを含むピペットをピペットホルダーに慎重に挿入し、ピペットがカチッと音を立てて適切に配置されていることを確認します。タッチスクリーンでStartを押し、電気パルスが届くまで待ちます。ステーションからピペットをゆっくりと取り外し、プッシュボタンをゆっくりと押して最初の停止まで押して、トランスセクトされた細胞懸濁液を、予め加温された抗生物質を含まない培地で対応するウェルに直ちに加える。プレートを形質移入細胞で穏やかに揺らし、加湿組織培養インキュベーター内で1〜3時間インキュベートし、次いで200マイクロリットルの予め加温した培養培地を各ウェルに加える。ディッシュをインキュベーターに入れ、遺伝子発現のために少なくとも24時間放置する。翌日、落射蛍光顕微鏡を用いて細胞生存率およびトランスフェクション効率を検査する。P-1000マイクロピペットで細胞から培地を慎重に取り出し、ウェルの側面に500マイクロリットルの刺激溶液を加えます。未処理のコントロールウェルを稼働させるには、刺激を与えずにイメージング培地を加える。落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を視覚化するには、指示に従って顕微鏡と蛍光光源をオンにします。10回または20回対物レンズを選択し、培養皿を顕微鏡ステージ上に置きます。アイピースで568ナノメートルフィルターの下の細胞を見つけます。レポーター赤血球を発現する細胞に着目した。視野内のすべての赤いセルを数えます。同じ視野で、488 または 512 フィルターに変更し、緑色の赤いセルの数を数えます。少なくとも 3 つのフィールドの赤セルを少なくとも 100 個数えます。視野あたりの金星陽性形質移入細胞の割合を計算し、得られたパーセンテージを各処理ウェルの平均化して標準偏差を求めます。落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化するには、カメラによって取得されたコンピュータ画面上の細胞のライブ画像を視覚化する。ジョイスティックコントロールとフォーカスホイールを使用して、セルのフォーカスと位置を微調整します。512 ナノメートルまたは 488 ナノメートルおよび 568 ナノメートルのレーザーのレーザー出力と露光時間の割合を設定して、画像内の信号が飽和せずに良好に見えるようにします。ライブキャプチャをオンにして、結果の画像を調べて、両方のチャンネルの表示ヒストグラムで各フロアに明確なピークが見られることを確認します。細胞のライブ画像を視覚化しながら、プレートの各ウェルについてmCherryまたはdsRedmitoレポーターを発現する1つ以上の細胞を含むフィールドの複数の代表画像を撮影する。GM-CSFと共に7日間インキュベートした選択されたCD-14陽性単球は、分化期間の経過にわたって細胞形態の変化を示し、球状の浮遊細胞からスピン状かつ完全に付着し、最後に、完全に分化するとより広がった細胞へと変化した。完全に分化した細胞を、レポータープラスミドdsRedmitoと共にカスパーゼBiFC対VCおよびVNで形質移入し、これを形質移入細胞を標識するために使用した。未処理の細胞は金星蛍光を示さなかった。そしてニゲリシン処理された細胞では、カスパーゼ-1 BiFCはASC斑点の典型的な形状を有する単一の穿刺として現れた。金星陽性MDMの定量は、LPSプラスニゲリシン治療群においてカスパーゼ−1 BiFCの最も高い割合が見られることを示した。カスパーゼ-1、4、および5つのpro-BiFCペアのプラスミド滴定では、金星陽性細胞の割合が最も高かったのは、それぞれ400、500、および1,000ナノグラムのトランスエクトプラスミドから生じました。細胞のフィールドを24時間後切除して得られた共焦点画像は、未処理の経流細胞がミトコンドリアが無傷であるように生存可能であることを示した。ヘムで処理した後、カスパーゼ-1複合体は、ニゲリシンによって誘導されるものと同様の単一の緑色の穿刺として現れる。分化、トランスフェクション、および治療中に細胞の過酷な条件や過度の操作は、自発的な活性化とカスパーゼ活性化の高いバックグラウンドレベルをもたらす可能性があるため、避けてください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

免疫・感染学

Activation and Measurement of NLRP3 Inflammasome Activity Using IL-1&#946; in Human Monocyte-derived Dendritic Cells

ヒト単球由来樹状細胞におけるIL-1βを用いて活性化し、NLRP3ソーム活性の測定

Inflammatory processes resulting from the secretion of Interleukin (IL)-1 family cytokines by immune cells lead to local or systemic inflammation, tissue ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

マクロファージコロニー刺激因子分化したヒト単球由来マクロファージの文化

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

全血からのヒト単球由来樹状細胞の生成

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Quantification of Monocyte Chemotactic Activity In Vivo and Characterization of Blood Monocyte Derived Macrophages

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

Tissue homeostasis and repair are critically dependent on the recruitment of monocyte-derived macrophages. Both under- and over-recruitment of ...

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase (G6PI)-Induced RA Mice

Adoptive Immunotherapy of iNKT Cells in Glucose-6-Phosphate Isomerase G6PI-Induced RA Mice

グルコース-6-リン酸イソメラーゼ(G6PI)誘発RAマウスにおけるiNKT細胞の導入免疫療法

Rheumatoid arthritis (RA) is a complex chronic inflammatory autoimmune disease. The pathogenesis of the disease is related to invariant natural killer T ...

In Vitro Stimulation and Visualization of Extracellular Trap Release in Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

分化ヒト単球由来マクロファージにおける細胞外トラップ放出のIn Vitro刺激と可視化

The release of extracellular traps (ETs) by neutrophils has been identified as a contributing factor to the development of diseases related to chronic ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

ウシ単球由来樹状細胞を用いたワクチン免疫原性の決定

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...