Name: visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages
Uploaded: 2022-04-06T12:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages at JoVE.com

Agradecemos aos membros do laboratório passado e presente da LBH que contribuíram para o desenvolvimento dessa técnica. Este laboratório é suportado por NIH/NIDDK T32DK060445 (BEB), NIH/NIDDK F32DK121479 (BEB), NIH/NIGMS R01GM121389 (LBH). A Figura 2 foi desenhada usando o software Biorender.

Este protocolo segue as diretrizes do comitê de ética em pesquisa humana da Baylor College of Medicine para a manipulação de amostras humanas. As amostras de sangue são tratadas seguindo as diretrizes institucionais de segurança para amostras humanas. As amostras de sangue são obtidas em um banco de sangue regional, onde são coletadas com solução de fosfato dextrose citrato (CPD). No entanto, o sangue coletado com outros anticoagulantes como heparina de sódio, heparina de lítio ou EDTA também pode ser usado ...

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Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos de monócitos isolados de amostras de sangue humano e um método para introduzir eficientemente os repórteres de Caspase Inflamatório BiFC em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular.
Este protocolo aproveita a técnica BiFC35 para marcar as caspases inflamatórias no domínio de recrutamento caspase (CARD) com fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente dividida V...

As caspases são uma família de proteases de cisteína aspartate que podem ser agrupadas em caspases iniciadores e caspases carrascos. As caspases carrascos compreendem caspase-3, -6 e -7. Eles são naturalmente encontrados em células como dimers e são cortados pelas caspases iniciadores para executar apoptose1. As caspases iniciais incluem caspase humana-1, -2, -4, -5, -8, -9, -10 e -12. Eles são encontrados como zymogens inativos (pro-caspases) que são ativados pela dimerização induzida pela proximidade e estabilizados pelo decote auto-proteolítico 2,3. As caspases inflamatórias são um subconjunto das caspasesiniciadores 2 e englobam caspase-1, -4, -5 e -12 em humanos, e caspase-1, -11 e -12 no rato 4,5. Em vez de um papel apoptótico, eles desempenham um papel central na inflamação. Eles mediam o processamento proteolítico e a secreção de pró-interleucina (IL)-1β e pró-IL-18 6,7, que são os primeiros citocinas a serem liberados em resposta aos invasores patogênicos 8,9. O Caspase-1 é ativado após o recrutamento para sua plataforma de ativação; um grande complexo de proteína de peso molecular denominado inflamado (Figura 1A)10. A dimerização da caspase-4, -5 e -11 ocorre independentemente dessas plataformas através de uma via inflamamsome nãocanônica11,12.
Os inflamamossscópios canônicos são complexos de proteína multimédica citosolic que consistem em uma proteína sensormasome inflamada, a proteína adaptadora ASC (proteína associada à apoptose contendo um CARD), e o caspase de proteína effectora-110. Os inflamatórios canônicos mais bem estudados são a família receptora semelhante ao NOD contendo um domínio de pirina (NLRP), NLRP1 e NLRP3, a família NLR contendo um CARD (NLRC), NLRC4, e a ausência no melanoma 2 (AIM2). Cada um deles contém um domínio pirin, um CARD ou ambos os domínios. O domínio CARD media a interação entre as caixas contendo cartão e seus ativadores upstream. Portanto, a molécula de andaime ASC, que é composta por um domínio de pirina n-terminal (PYD) e um motivo de CARD terminal C13,14, é necessária para o recrutamento de caspase-1 para o NLRP110, NLRP315 e AIM216 inflamações.
Cada inflamatório é nomeado após sua proteína sensorada única que reconhece distintos estímulos pró-inflamatórios (Figura 1B). Ativadores desta via são denominados estímulos canônicos. Os inflamatórios servem como sensores para componentes microbianos e estresse tecidual, e montam-se para desencadear uma resposta inflamatória robusta através da ativação das caspases inflamatórias17. A montagem inflamada inicia a ativação caspase-1 para mediar a maturação e a secreção de seus substratos principais pró-IL-1β e pró-IL-18. Esse processo ocorre através de um mecanismo de duas etapas. Primeiro, um estímulo de priming regula a expressão de certas proteínas inflamadas e pró-IL-1β através da ativação da via NF-κB. Em segundo lugar, um estímulo intracelular (canônico) induz a montagem inflamada e o recrutamento de procaspase-1 6,7.
Caspase-4 e caspase-5 são os ortopedes humanos da caspase murina-1111. Eles são ativados de forma inflamada e independente por lipopolysacarídeo intracelular (LPS), uma molécula encontrada na membrana externa das bactérias Gram-negativas18,19,20, e por heme extracelular, um produto da hemólise de glóbulos vermelhos21. Foi proposto que o LPS se liga diretamente ao motivo card dessas proteínas e induz sua oligomerização20. A ativação do caspase-4 ou caspase-5 promove a liberação do IL-1β induzindo uma forma inflamatória de morte celular chamada piroptose através do decote da proteína gasdermin D (GSDMD)18,19. Além disso, o efflux de íons de potássio resultantes da morte piropopótica mediada por caspase-4 e GSDMD induz a ativação do inflamador NLRP3 e posterior ativação do caspase-122,23. Portanto, caspase-4, -5 e -11 são considerados sensores intracelulares para LPS que são capazes de induzir piroptose e ativação caspase-1 em resposta a estímulos específicos11,24.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63162/63162fig01.jpg"> Figura 1: Caspases inflamatórias e ensaio de complementação de fluorescência caspase-bimolecular (BiFC). (A) Diagrama mostrando o sistema caspase-BiFC, onde dois prodomínios caspase-1 (C1-pro) ligados a cada fragmento não fluorescente de Vênus (Venus-C ou Venus-N) são recrutados para a plataforma de ativação NLRP3, forçando Vênus a se repatar e fluorescer. Este complexo aparece como uma mancha verde sob o microscópio e serve como uma leitura para a proximidade inflamatória induzida por caspase, que é o primeiro passo na ativação do caspase iniciador. (B) Esquema mostrando a organização do domínio de componentes inflamatórios e caspases inflamatórias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63162/63162fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Medir a ativação específica de caspases iniciadores é difícil, e não há muitos métodos disponíveis para fazê-lo por abordagens de imagem. A Complementação da Fluorescência Bimolecular Caspase (BiFC) pode ser usada para visualizar a ativação inflamatória de caspase diretamente em células vivas (Figura 1A)25. Esta técnica foi recentemente adaptada para uso em macrófagos derivados de monócitos humanos (MDM)21. Caspase BiFC mede o primeiro passo na ativação inflamatória de caspase, induzida proximidade para facilitar a dimerização. A expressão de plasmídeos que codificam o caspase prodomínio contendo card fundido a fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente amarela fotostável Vênus (Venus-C [VC]) e Venus-N [VN]) são usados. Quando os dois prodomínios caspase são recrutados para sua plataforma de ativação ou sofrem proximidade induzida, as duas metades de Vênus são trazidas de perto e forçadas a se reabastecer e fluoresce (ver Figura 1A,B). Isso fornece uma leitura em tempo real da ativação específica de caspase inflamatória.
O MDM humano expressa abundantemente genes inflamados e receptores de reconhecimento de padrões que identificam sinais de perigo e produtos patógenos. Isso fornece um tipo de célula ideal para o interrogatório de vias inflamatórias caspase. Além disso, podem ser derivados do sangue periférico e até mesmo de amostras de pacientes para avaliar a ativação inflamatória de caspase em um estado específico da doença. Este protocolo descreve como introduzir os repórteres de caspase BiFC no MDM usando nucleofecção, um método de transfecção baseado em eletroporação, como tratar as células para induzir a ativação inflamatória do caspase e como visualizar os complexos ativos de caspase usando abordagens de microscopia. Além disso, essa metodologia pode ser adaptada para determinar a composição molecular desses complexos, localização subcelular, cinética e tamanho dessas estruturas altamente ordenadas 25,26,27.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>48 well tissue culture2:34 plates</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Tissue Culture Dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 Mercaptoethanol 1000x</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 well chambered coverglass with 1.5 HP coverglass</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>c8-1.5H-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-021-101</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-545</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Pro Washing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-092-987</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>For automated separation using AutoMACS Pro Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMacs running buffer</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1 motorized inverted microscope equipped with a CSU-X1A 5000 spinning disk unit</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any confocal microscope equipped with a laser module fitted with laser lines of 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioObserver A1, Research Grade Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any epifluorescence microscope with fluorescence filters capable of exciting 568 nm (RFP) and 488 or 512 nm (GFP or YFP) wavelengths can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14+ MICROBEADS</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>For manual or automated separation using QuadroMACS or AutoMACS pro Separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537-6x500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DsRed mito plasmid</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>632421</td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS 6 x 100 mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>GE17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35050079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GM-CSF</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>PHC2011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemin BioXtra, from Porcine, &#8805;96.0% (HPLC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51280-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inflammatory caspase BiFC plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available by request from LBH lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LPS-EB Ultrapure</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-3PELPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Columns</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS 15 mL Tube Rack</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-091-052</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry plasmid</td>
			<td>Yungpeng Wang Lab</td>
			<td></td>
			<td>Similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Includes Neon electroporation device, pipette and pipette station</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neon Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK1096</td>
			<td>Includes resuspension buffer R, resuspension buffer T, electrolytic buffer E, 96 x 10 &#181;L Neon tips and Neon electroporation tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin sodium salt, ready made solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML1779-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine Hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7280-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuadroMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi (Biotec)</td>
			<td>130-090-976</td>
			<td>For manual separation using QuadroMACS Separator only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qVD-OPh</td>
			<td>Fisher (ApexBio)</td>
			<td>50-101-3172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Zen 2.6 (blue edition) software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Any software used to operate the confocal microscope of choice</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of inflammatory caspases induced proximity in human monocyte-derived macrophages

As caspases inflamatórias incluem caspase-1, -4, -5, -11 e -12 e pertencem ao subgrupo de caspases iniciadores. O Caspase-1 é necessário para garantir a correta regulação da sinalização inflamatória e é ativado pela dimerização induzida pela proximidade após o recrutamento para inflamações. Caspase-1 é abundante na linhagem celular monocítica e induz a maturação das citocinas pró-inflamatórias interleucina (IL)-1β e IL-18 a moléculas secretas ativas. As outras caspases inflamatórias, caspase-4 e -5 (e seu caspase-11 homólogo murino) promovem a liberação de IL-1β induzindo a piroptose. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) é uma ferramenta usada para medir a proximidade induzida por caspase inflamatória como uma leitura da ativação do caspase. O caspase-1, -4, ou -5 prodomínio, que contém a região que se liga ao inflamatório, é fundido a fragmentos não fluorescentes da proteína fluorescente amarela Vênus (Venus-N [VN] ou Venus-C [VC]) que associam a reforma do complexo fluorescente de Vênus quando as caspas sofrem proximidade induzida. Este protocolo descreve como introduzir esses repórteres em macrófagos derivados do monócito humano primário (MDM) usando nucleofeipulsão, tratar as células para induzir ativação inflamatória de caspase e medir a ativação de caspase usando fluorescência e microscopia confocal. A vantagem dessa abordagem é que ela pode ser usada para identificar os componentes, requisitos e localização do complexo de ativação inflamatória de caspase em células vivas. No entanto, controles cuidadosos precisam ser considerados para evitar comprometer a viabilidade e o comportamento celular. Esta técnica é uma poderosa ferramenta para a análise de interações dinâmicas de caspase no nível inflamatório, bem como para o interrogatório das cascatas inflamatórias de sinalização em MDM vivos e monócitos derivados de amostras de sangue humano.

O esquema mostrado na Figura 2 dá uma visão geral de como obter, transfetar e imagem humana MDM. Após a incubação dos monócitos CD14+ selecionados com GM-CSF por 7 dias, a morfologia celular muda ao longo do período de diferenciação (Figura 3A), passando de células de suspensão esféricas para spindly e totalmente anexadas (dias 3 e 4), e, por último, para células mais difundidas quando totalmente diferenciadas (dia 7). As células totalmente difer...

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Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para obter macrófagos derivados de monócitos (MDM) a partir de amostras de sangue humano, um método simples para introduzir eficientemente os repórteres de complementação de fluorescência bimolecular inflamatória (BiFC) em MDM humano sem comprometer a viabilidade e o comportamento celular, e uma abordagem baseada em imagens para medir a ativação inflamatória de caspase em células vivas.

Visualização de Caspases Inflamatórias Induzidas proximidade em macrófagos derivados de monócitos humanos

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Este protocolo é significativo porque pode ser usado para visualizar e interrogar a via de caspase inflamatória a nível molecular em células vivas em um determinado estado de doença. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode ser usada para identificar os componentes, requisitos e localização dos complexos de ativação inflamatória de caspase em células imunes primárias. Com pequenas otimizações, este método pode ser adaptado a outras células primárias e uma gama de proteínas ativadas pela oligomerização, e sua aplicabilidade não se limita a metodologias microscópicas.Primeiro, aspire a mídia de macrófagos totalmente diferenciados em pratos de 10 centímetros e lave a monocamada celular com meio RPMI-1640 livre de soro quente, removendo toda a mídia completamente. Colher as células adicionando dois mililitros de solução de trypsin-EDTA 0,25% quente por prato de 10 centímetros. Pipeta suavemente o trypsin-EDTA para cima e para baixo sobre todo o prato com uma micropipette P-1000, em seguida, transfira a suspensão para um tubo cônico de 15 mililitros contendo cinco mililitros de meio de cultura completa quente.Verifique se há desprendimento celular sob um microscópio de campo brilhante e desprende novamente, se necessário. Aspire o médio e resuspenque as células em 10 mililitros de PBS estéreis de 1X pré-aquecidos a 37 graus Celsius. Em seguida, tome uma alíquota de 20 microliter para determinar o número da célula usando um hemócito.Pegue de uma a duas vezes 10 a 5 células por transfecção e coloque-as em um tubo de 15 mililitros. Leve a um volume final de 15 mililitros com PBS estéril 1X pré-aquecido. Aspire o PBS e centrífuga mais uma vez por um minuto a 250 x g.Remova qualquer PBS residual da pelota celular usando uma micropipette P-200. Pegue um microtubo estéril de 1,5 mililitro por transfecção e adicione o plasmídeo de repórter apropriado e plasmídeos BiFC caspase no capô. Coloque a estação de pipeta, dispositivo, pontas, tubos de eletroporação e pipeta em uma coifa de fluxo laminar estéril.Conecte-se e ligue o dispositivo de nucleofecção. Digite os parâmetros de transeção na tela de inicialização exibida. Pressione a Voltagem, digite 1000 e pressione em Done para configurá-la em 1000 volts.Pressione a Largura, digite 40 e pressione "Feito" para definir o pulso em 40 milissegundos. Por fim, pressione os pulsos, digite 2 e pressione o Feito para definir o número de pulsos elétricos para 2. Pegue um dos tubos de eletroporação e encha-o com três mililitros de tampão eletrolítico E à temperatura ambiente.Insira o tubo de eletroporação no suporte da pipeta na estação pipeta, garantindo que o eletrodo na lateral do tubo esteja voltado para dentro e um som de clique seja ouvido quando o tubo é inserido. Pegue a pelota celular e adicione 10 microliters de tampão R de resuspensão pré-aquecida para cada uma a duas vezes 10 às quintas células, e misture suavemente com uma micropipette P-20. Adicione 10 microlitadores da suspensão celular a cada tubo de transfecção e misture delicadamente com uma micropipette P-20.Insira uma ponta na pipeta pressionando o botão de pressão para a segunda parada, garantindo que o grampo pegue completamente a haste de montagem do pistão na ponta. Em seguida, pressione o botão de apertar a pipeta até a primeira parada e mergulhe no primeiro tubo contendo mistura de DNA celular ou plasmídeo para aspirar a amostra. Insira a pipeta com a amostra com muito cuidado no suporte da pipeta, garantindo que a pipeta clique e seja colocada adequadamente.Pressione a tela de toque e espere até que os pulsos elétricos sejam entregues. Remova lentamente a pipeta da estação e adicione imediatamente a suspensão celular transctoida no poço correspondente com o meio pré-aquecido sem antibióticos pressionando lentamente o botão de pressão para a primeira parada. Balance suavemente a placa com células transectadas e incubar por uma a três horas em uma incubadora de cultura tecidificada, em seguida, adicione 200 microliters de meio de cultura pré-aquecido para cada poço.Coloque o prato na incubadora e deixe pelo menos 24 horas para a expressão genética. No dia seguinte, inspecione a viabilidade celular e a eficiência da transfecção usando um microscópio de epifluorescência. Remova a mídia das células cuidadosamente com uma micropipette P-1000 e adicione 500 microliters da solução de estímulo ao lado do poço.Para executar poços de controle não tratados, adicione um meio de imagem sem o estímulo. Para visualizar as células usando uma epifluorescência ou microscópio confocal, ligue o microscópio e a fonte de luz fluorescente seguindo as instruções. Selecione o objetivo de 10 ou 20 vezes e coloque o prato de cultura no palco do microscópio.Encontre células sob o filtro de 568 nanômetros com a peça do olho. E concentre-se nas células expressando as células vermelhas do repórter. Conte todas as células vermelhas no campo visual.Enquanto no mesmo campo visual, mude para os filtros 488 ou 512, conte o número de células vermelhas que também são verdes. Conte pelo menos 100 células vermelhas de três campos mínimos. Calcule a porcentagem de células transectadas positivas de Vênus por campo visual e média das porcentagens resultantes de cada tratamento bem para obter o desvio padrão.Para visualizar as células usando uma epifluorescência ou microscópio confocal, visualize a imagem ao vivo das células na tela do computador, conforme adquirido pela câmera. Ajuste bem o foco e a posição das células usando o controle de joystick e a roda de foco. Defina a porcentagem de potência laser e o tempo de exposição para os lasers de 512 nanômetros ou 488 nanômetros e 568 nanômetros, de modo que o sinal na imagem pareça bom sem saturação.Ligue a captura ao vivo e examine a imagem resultante, garantindo que um pico distinto seja visto para cada andar nos histogramas de exibição para ambos os canais. Ao visualizar a imagem ao vivo das células, pegue várias imagens representativas de um campo que contém uma ou mais células expressando o repórter mCherry ou dsRedmito para cada poço da placa. Os monócitos positivos cd-14 selecionados incubados com GM-CSF por sete dias mostraram alterações na morfologia celular ao longo do período de diferenciação, indo de células de suspensão esféricas para spindly e totalmente ligadas, e por último, a células mais difundidas quando totalmente diferenciadas.Células totalmente diferenciadas foram transectadas com os pares caspase BiFC VC e VN, juntamente com o repórter plasmid dsRedmito, que foi usado para rotular as células transectadas. Células não tratadas não mostraram fluorescência de Vênus. E nas células tratadas com níger, o Caspase-1 BiFC apareceu como um único punctum com a forma típica de manchas ASC.A quantitação do MDM venus positivo mostrou que a maior porcentagem de caspase-1 BiFC é vista no grupo de tratamento LPS mais nigericin. Na titulação plasmida de caspase-1, 4 e 5 pares pró-BiFC, a maior porcentagem de células positivas de Vênus resultou de 400, 500 e 1.000 nanogramas de plasmídeos transectados, respectivamente. Imagens confocal obtidas com um objetivo 20 vezes objetivo de um campo de células 24 horas após a transeção mostraram que as células transectadas não tratadas são viáveis à medida que as mitocôndrias estão intactas.Após o tratamento com heme, o complexo caspase-1 aparece como um único punctum verde semelhante ao induzido pela nigericina. Lembre-se de evitar condições severas e manipulação excessiva das células durante a diferenciação, transfecção e tratamento, pois pode resultar em uma ativação espontânea e altos níveis de fundo de ativação de caspase.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

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Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo de Co-infecção para Estudar<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacções em monócitos humanos primários derivados de células imunes

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

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Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...