Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af JSPS KAKENHI bevillingsnummer 18K14824 og 21K15195 og en intern bevilling fra AIST, Japan.

Alle forsøgsprotokoller blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafisk og medaka blev vedligeholdt i henhold til standardprocedurer28.
1. Stiksårskade i voksenoptisk tektum
<ol><li>Forbered en 0,4% (w / v) tricainstamopløsning til anæstesi. For en 100 ml stamopløsning opløses 400 mg tricainmethansulfonat (se materialetabel) i 90 ml dest...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Her beskrives et sæt metoder, som kan bruges til at fremkalde stiksårskader i det optiske tektum ved hjælp af en nål for at lette evalueringen af RGC-spredning og differentiering efter hjerneskade. Nålemedierede stiksår er en enkel, effektivt implementeret metode, der kan anvendes på mange eksperimentelle prøver ved hjælp af et standard sæt værktøjer. Derer udviklet modeller for stiksårskader for flere områder af zebrafiskens hjerne 3,19,29.</s...

Zebrafisk (Danio rerio) har en øget evne til at regenerere deres centralnervesystem (CNS) sammenlignet med andre pattedyr 1,2,3. For nylig, for bedre at forstå de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne øgede regenerative kapacitet, er komparative analyser af vævsregenerering ved hjælp af næste generations sekventeringsteknologi blevet udført 4,5,6. Hjernestrukturerne hos zebrafisk og tetrapoder er helt forskellige 7,8,9. Det betyder, at flere hjerneskademodeller ved hjælp af små fisk med lignende hjernestrukturer og biologiske træk er blevet udviklet for at lette undersøgelsen af de underliggende molekylære mekanismer, der bidrager til denne øgede regenerative kapacitet.
Derudover er medaka (Oryzias latipes) et populært forsøgsdyr med en lav kapacitet til hjerte- og neuronal regenerering10,11,12,13 sammenlignet med zebrafisk. Zebrafisk og medaka har lignende hjernestrukturer og nicher til voksne neurale stamceller (NSC'er)14,15,16,17. I zebrafisk og medaka omfatter det optiske tectum to typer NSC'er, neuroepitellignende stamceller og radiale gliaceller (RGC'er)15,18. Der er tidligere udviklet en stiksårskade for det optiske tektum hos voksne zebrafisk, og denne model blev brugt til at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer hjernens regenerering hos disse dyr 19,20,21,22,23. Denne unge voksne zebrafisk stiksårsskademodel inducerede regenerativ neurogenese fra RGC'er 19,24,25. Denne stiksårskade i det optiske tektum er en robust og reproducerbar metode 13,19,20,21,22,23,24,25. Da den samme skademodel blev anvendt på voksen medaka, blev RGC'ernes lave neurogene kapacitet i medaka optisk tectum afsløret via den komparative analyse af RGC-proliferation og differentiering efter skade13.
Der er også udviklet modeller for stiksårsskader i det optiske tektum i mummichog-modeller26, men detaljer om tectum-skaden er ikke veldokumenterede sammenlignet med telencephalicskade27. Stiksårskaden i det optiske tektum ved hjælp af zebrafisk og medaka muliggør undersøgelse af differentialcellulære reaktioner og genekspression mellem arter med differentiel regenerativ kapacitet. Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en stiksårskade i det optiske tektum ved hjælp af en injektionsnål. Denne metode kan anvendes på små fisk som zebrafisk og medaka. Processerne til prøveforberedelse til histologisk analyse og cellulær proliferation og differentieringsanalyse ved anvendelse af fluorescerende immunhistokemi og kryosektioner forklares her.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Mens zebrafisk har en overlegen kapacitet til at regenerere deres centralnervesystem (CNS), har medaka en lavere CNS regenerativ kapacitet. En hjerneskademodel blev udviklet i det voksne optiske tektum hos zebrafisk og medaka, og komparative histologiske og molekylære analyser blev udført for at belyse de molekylære mekanismer, der regulerer vævets høje regenerative kapacitet på tværs af disse fiskearter. Her præsenteres en stiksårskademodel for det voksne optiske tektum ved hjælp af en nål og histologiske analyser for spredning og differentiering af de neurale stamceller (NSC'er). En nål blev manuelt indsat i det centrale område af det optiske tectum, og derefter blev fisken intrakardialt perfuseret, og deres hjerner blev dissekeret. Disse væv blev derefter kryosektioneret og evalueret ved hjælp af immunfarvning mod de relevante NSC-proliferations- og differentieringsmarkører. Denne tectum-skademodel giver robuste og reproducerbare resultater i både zebrafisk og medaka, hvilket gør det muligt at sammenligne NSC-responser efter skade. Denne metode er tilgængelig for små teleoster, herunder zebrafisk, medaka og afrikansk killifish, og gør det muligt for os at sammenligne deres regenerative kapacitet og undersøge unikke molekylære mekanismer.

Stiksårskade i det optiske tektum ved hjælp af nåleindsættelse i højre halvkugle (figur 1, figur 4A og figur 5A) inducerer forskellige cellulære reaktioner, herunder proliferation af radial gliacelle (RGC) og generering af nyfødte neuroner. På samme måde blev ældre populationer af zebrafisk og medaka brugt til at modvirke eventuelle aldringseffekter i det regenerative respons. Derefter blev fluorescerende immunfarvning udf...

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

En mekanisk hjerneskademodel i de voksne zebrafisk beskrives for at undersøge de molekylære mekanismer, der regulerer deres høje regenerative kapacitet. Metoden forklarer at skabe en stiksårskade i det optiske tektum hos flere arter af små fisk for at evaluere de regenerative reaktioner ved hjælp af fluorescerende immunfarvning.

Stiksårskademodel af voksenoptisk tektum ved hjælp af zebrafisk og medaka til sammenlignende analyse af regenerativ kapacitet

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Stiksårskade er en mekanisk skademetode, der inducerer uspecifik celleablation. Denne metode letter evalueringen af RGC-spredning og differentiering efter hjerneskade. Nålemedieret stiksårskade er en enkel, effektivt implementeret metode til at fremkalde hjerneskade.Denne metode kan anvendes på mange eksperimentelle prøver ved hjælp af et standard sæt værktøjer. Zebrafiskens regenerative kapacitet blev illustreret ved hjælp af stiksårsskademodellen. Ny indsigt i molekylær mekanisme, der regulerer neuronal regenerering, bidrager til regenerativ terapi i centralnervesystemet.Begynd med at placere en bedøvet voksen zebrafisk eller medaka på en styrofoambakke. Fastgør fisken lodret mellem to 30-gauge nåle indsat lodret i styrofoam. Hold fiskekroppen for at forhindre fiskehovedet i at bevæge sig, og indsæt derefter lodret en 30-gauge nål gennem kraniet ind i det mediale område af en af de optiske tectumkugler.Overfør derefter den skadede fisk til et akvarium med ferskvandsvand. Når fisken er helt genoprettet fra anæstesi, skal du flytte tanken til avlssystemet. Læg papirhåndklæder på styrofoambakken for at placere den bedøvede fisk.Hold derefter fiskekroppen på plads ved lodret at indsætte to 30-gauge nåle på hver side af analfinnen. Når fisken er placeret, lav et ventralt snit fra anus til hjertet. Hold hjertet synligt ved at indsætte to 30-gauge nåle på hver side.Brug derefter spidsen af tangen til at fjerne sølvepitellaget. Indsæt 30-gauge nålen i ventriklen, hold skråningen op, og lav et snit i atriumet ved hjælp af tangen. Skub derefter PBS ind i atriumet ved at trykke ned på sprøjten for at skylle blodet fra atriummet.Når blodet er drænet, og gællerne bliver hvide, skal du stoppe PBS-perfusionen. Senere skal du fjerne nålene, der fastgør fiskekroppen på plads, og fastgør fiskens ventrale side nedad. Efter at have skåret rygmarven og fjernet kraniet fra optisk tectum og telencephalon, skære synsnerverne og dissekere hjernen.Overfør derefter hjernen til 1,5 milliliter rør med en milliliter 4% paraformaldehyd i PBS for at fiksere natten over ved fire grader Celsius. Efter at have vasket de faste hjerner tre gange i PBS i fem minutter hver, overføres hjernen til 1,5 milliliter rør med en milliliter 30 volumenprocent saccharose i PBS som kryoprotektant og inkuberer dem natten over ved fire grader Celsius. Forbered indlejringsforbindelsen ved at kombinere 30% saccharose med 30 ml optimal skæretemperatur eller OCT-forbindelse, og opbevar forbindelsen ved fire grader Celsius.For at afkøle cryomold en gang skal du inkubere en aluminiumsblok natten over ved minus 80 grader Celsius og sætte den forkølede blok i en styrofoamkasse med låg for at forhindre opvarmning. For koronale sektioner skal du integrere den dissekerede hjerne i en cryomold ved at justere orienteringen ved hjælp af tang under mikroskopet. Placer derefter cryomold på den forkølede aluminiumsblok i styrofoamboksen, og lad OCT-forbindelsen fryse og blive hvid.Når forbindelsen fryser, påføres en lille cirkel OCT-forbindelse på en prøveskive, inden kryoblokken monteres på prøveskiven. Ved at placere prøveskiven i kryostaten fryses OCT-forbindelsen. Derefter anbringes prøveskiven på prøvehovedet i kryostaten.Når du har indstillet kryoblokkens retning, skal du trimme OCT for at fjerne eventuelle ekstra regioner. Skær 14 mikrometer tykke serielle sektioner gennem hele det optiske tektum ved hjælp af en kryostat, og opbevar diasene ved minus 25 grader Celsius. Den radiale gliacelle, eller RGC, proliferation i hjernevævet hos zebrafisk blev evalueret.De fleste RGC'er prolifererede celleantigen negative i den kontralaterale uskadte halvkugle. To dage efter skaden blev RGC-spredning induceret på den skadede side af medaka tectum. Efter hjerneskaden blev celleafstamning og RGC-differentiering evalueret med bromodeoxyuridin eller BrdU-mærkning.Den repræsentative analyse viser nyfødte neuroner syv dage efter skaden hos de skadede zebrafisk og medaka. Et af de kritiske trin i stiksårskader er manuel nålindsættelse. En konsistent skade er nødvendig for at skabe reproducerbare resultater.Fluorescerende farvestoffer er effektive som sårmarkører. Omfanget af fluorescerende farvestofdiffusion angiver placeringen og dybden af stiksårskaden. Denne teknik er potentielt tilpasset andre små fiskearter, og tilpasning til medaka giver mulighed for sammenligninger af regenerativ kapacitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nyre Regeneration i Adult Zebrafisk af Gentamicin induceret skade

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Saltholdighed-afhængige Toksicitet Analyse af Silver Nanocolloids Brug Medaka Æg

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolering og Udvidelse af Voksen Canine Hippocampale Neural Forstadier

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging af transgene genekspression i Individuel Retinal progenitorer i kimære zebrafisk embryoner til Studieinformationen Cell Nonautonomous påvirkninger

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

En Seminiferous tubulus Squash teknik til cytologiske analyse af spermatogenesen ved hjælp af musen Model

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Voksen zebrafisk skade modeller at studere virkningerne af Prednisolon i regenererende knoglevæv

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering af Tangential celle Migration i den udviklende Chick optiske Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kortlægning af den emergente rumlige organisering af pattedyrsceller ved hjælp af Mikromønstre og kvantitativ billeddannelse

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...