Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 en 21K15195 en een interne subsidie van AIST, Japan.

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebravis en medaka werden onderhouden volgens standaardprocedures28.
1. Steekwondletsel in het volwassen optische tectum
<ol><li>Bereid een 0,4% (w / v) tricaïne-stamoplossing voor anesthesie. Los voor een stamoplossing van 100 ml 400 mg tricaïnemethaansulfonaat (zie ...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Hier wordt een reeks methoden beschreven die kunnen worden gebruikt om steekwondletsels in het optische tectum te induceren met behulp van een naald om de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel te vergemakkelijken. Naaldgemedieerde steekwonden zijn een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode die op veel experimentele monsters kan worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Steekwondletselmodellen voor verschillende regio's van het zebravisbrein zijn ontwikkeld <sup ...

Zebravissen (Danio rerio) hebben een verhoogd vermogen om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren in vergelijking met andere zoogdieren 1,2,3. Onlangs, om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit beter te begrijpen, zijn vergelijkende analyses van weefselregeneratie met behulp van next-generation sequencing-technologie uitgevoerd 4,5,6. De hersenstructuren bij zebravissen en tetrapoden zijn heel verschillend 7,8,9. Dit betekent dat verschillende hersenletselmodellen met behulp van kleine vissen met vergelijkbare hersenstructuren en biologische kenmerken zijn ontwikkeld om het onderzoek naar de onderliggende moleculaire mechanismen die bijdragen aan deze verhoogde regeneratieve capaciteit te vergemakkelijken.
Bovendien is medaka (Oryzias latipes) een populair proefdier met een lage capaciteit voor hart- en neuronale regeneratie10,11,12,13 in vergelijking met zebravissen. Zebravissen en medaka hebben vergelijkbare hersenstructuren en niches voor volwassen neurale stamcellen (NSC's)14,15,16,17. Bij zebravissen en medaka omvat het optische tectum twee soorten NSC's, neuro-epitheliale-achtige stamcellen en radiale gliacellen (RGC's)15,18. Een steekwondletsel voor het optische tectum van volwassen zebravissen werd eerder ontwikkeld en dit model werd gebruikt om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die de hersenregeneratie bij deze dieren reguleren 19,20,21,22,23. Dit jongvolwassen zebravis steekwond letsel model geïnduceerde regeneratieve neurogenese van RGCs 19,24,25. Dit steekwondletsel in het optische tectum is een robuuste en reproduceerbare methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Toen hetzelfde letselmodel werd toegepast op volwassen medaka, werd de lage neurogene capaciteit van RGC's in medaka optisch tectum onthuld via de vergelijkende analyse van RGC-proliferatie en differentiatie na letsel13.
Steekwondletselmodellen in het optische tectum zijn ook ontwikkeld in mummichog-modellen26, maar details van het tectumletsel zijn niet goed gedocumenteerd in vergelijking met telencefalisch letsel27. Het steekwondletsel in het optische tectum met behulp van zebravissen en medaka maakt het mogelijk om de differentiële cellulaire responsen en genexpressie tussen soorten met differentieel regeneratief vermogen te onderzoeken. Dit protocol beschrijft hoe een steekwondletsel in het optische tectum moet worden uitgevoerd met behulp van een injectienaald. Deze methode kan worden toegepast op kleine vissen zoals zebravissen en medaka. De processen voor monstervoorbereiding voor histologische analyse en cellulaire proliferatie- en differentiatieanalyse met behulp van fluorescerende immunohistochemie en cryosecties worden hier uitgelegd.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Terwijl zebravissen een superieur vermogen hebben om hun centrale zenuwstelsel (CZS) te regenereren, heeft medaka een lager CZS-regeneratief vermogen. Een hersenletselmodel werd ontwikkeld in het volwassen optische tectum van zebravissen en medaka en vergelijkende histologische en moleculaire analyses werden uitgevoerd om de moleculaire mechanismen op te helderen die de hoge regeneratieve capaciteit van dit weefsel bij deze vissoorten reguleren. Hier wordt een steekwondletselmodel gepresenteerd voor het volwassen optische tectum met behulp van een naald en histologische analyses voor proliferatie en differentiatie van de neurale stamcellen (NSC's). Een naald werd handmatig ingebracht in het centrale gebied van het optische tectum, en vervolgens werden de vissen intracardiaal doordrenkt en hun hersenen werden ontleed. Deze weefsels werden vervolgens gecryosectie en geëvalueerd met behulp van immunostaining tegen de juiste NSC-proliferatie- en differentiatiemarkers. Dit tectumletselmodel biedt robuuste en reproduceerbare resultaten in zowel zebravissen als medaka, waardoor NSC-responsen na letsel kunnen worden vergeleken. Deze methode is beschikbaar voor kleine teleosts, waaronder zebravissen, medaka en Afrikaanse killivissen, en stelt ons in staat om hun regeneratieve capaciteit te vergelijken en unieke moleculaire mechanismen te onderzoeken.

Steekwondletsel in het optische tectum met behulp van naaldinbrenging in de rechterhersenhelft (figuur 1, figuur 4A en figuur 5A) induceert verschillende cellulaire reacties, waaronder radiale gliacelproliferatie (RGC) en het genereren van pasgeboren neuronen. Evenzo werden verouderde populaties van zebravissen en medaka gebruikt om eventuele verouderingseffecten in de regeneratieve respons tegen te gaan. Vervolgens werd fluorescere...

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Een mechanisch hersenletselmodel bij de volwassen zebravis wordt beschreven om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die hun hoge regeneratieve capaciteit reguleren. De methode legt uit om een steekwondletsel te creëren in het optische tectum van meerdere soorten kleine vissen om de regeneratieve reacties te evalueren met behulp van fluorescerende immunostaining.

Steekwondletselmodel van het volwassen optische tectum met behulp van zebravissen en medaka voor de vergelijkende analyse van regeneratieve capaciteit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Steekwondletsel is een mechanische letselmethode die niet-specifieke celablatie induceert. Deze methode vergemakkelijkt de evaluatie van RGC-proliferatie en differentiatie na hersenletsel. Naaldgemedieerd steekwondletsel is een eenvoudige, efficiënt geïmplementeerde methode om hersenletsel op te wekken.Deze methode kan op veel experimentele monsters worden toegepast met behulp van een standaardset gereedschappen. Het regeneratieve vermogen van zebravissen werd geïllustreerd met behulp van het steekwondletselmodel. Nieuwe inzichten in moleculaire mechanismen die neuronale regeneratie reguleren, dragen bij aan regeneratieve therapie in het centrale zenuwstelsel.Begin met het plaatsen van een verdoofde volwassen zebravis of medaka op een piepschuimen bakje. Bevestig de vis rechtop tussen twee naalden van 30 gauge die verticaal in het piepschuim zijn gestoken. Houd het vissenlichaam vast om te voorkomen dat de vissenkop beweegt en steek vervolgens verticaal een naald van 30 gauge door de schedel in het mediale gebied van een van de optische tectumbollen.Breng vervolgens de gewonde vis over in een aquarium met vers visfaciliteitswater. Zodra de vissen volledig zijn hersteld van de anesthesie, verplaatst u de tank naar het kweeksysteem. Leg papieren handdoeken op de piepschuimen bak om de verdoofde vis te plaatsen.Houd vervolgens het vislichaam op zijn plaats door verticaal twee naalden van 30 gauge aan weerszijden van de anaalvin in te brengen. Zodra de vis is geplaatst, maakt u een ventrale incisie van de anus naar het hart. Houd het hart zichtbaar door aan elke kant twee naalden van 30 meter in te brengen.Gebruik vervolgens de punt van de tang om de zilveren epitheellaag te verwijderen. Steek de 30-gauge naald in de ventrikel, houd de schuine kant omhoog en maak een incisie in het atrium met behulp van de tang. Duw vervolgens PBS in het atrium door op de spuit te drukken om het bloed uit het atrium te spoelen.Wanneer het bloed is afgevoerd en de kieuwen wit worden, stopt u de PBS-perfusie. Verwijder later de naalden die het vislichaam op zijn plaats bevestigen en bevestig de ventrale kant van de vis naar beneden. Na het doorsnijden van het ruggenmerg en het verwijderen van de schedel uit het optische tectum en telencephalon, snijdt u de oogzenuwen door en ontleedt u de hersenen.Breng vervolgens de hersenen over in buizen van 1,5 milliliter met één milliliter 4% paraformaldehyde in PBS, om 's nachts te fixeren op vier graden Celsius. Na het wassen van de vaste hersenen drie keer in PBS gedurende vijf minuten elk, breng de hersenen over in buizen van 1,5 milliliter met één milliliter van 30% gewicht per volume sucrose in PBS als een cryoprotectant en incuber ze 's nachts bij vier graden Celsius. Bereid de insluitverbinding voor door 30% sucrose te combineren met 30 milliliter optimale snijtemperatuur, of OCT, verbinding en bewaar de verbinding bij vier graden Celsius.Om de cryomold eenmaal af te koelen, incubeer je een aluminium blok 's nachts bij min 80 graden Celsius en plaats je het voorgekoelde blok in een piepschuimen doos met een deksel om opwarming te voorkomen. Voor coronale secties sluit u de ontleedde hersenen in een cryomold in door de oriëntatie aan te passen met behulp van een tang onder de microscoop. Plaats vervolgens de cryomold op het voorgekoelde aluminiumblok in de piepschuimen doos en laat de OCT-verbinding bevriezen en wit worden.Terwijl de verbinding bevriest, brengt u een kleine cirkel OCT-verbinding aan op een monsterschijf voordat u het cryoblok op de monsterschijf monteert. Door de monsterschijf in de cryostaat te plaatsen, vriest u de OCT-verbinding in. Plaats vervolgens de monsterschijf op de monsterkop in de cryostaat.Nadat u de oriëntatie van het cryoblok hebt ingesteld, knipt u de OCT bij om eventuele extra gebieden te verwijderen. Snijd 14 micrometer dikke seriële secties door het hele optische tectum met behulp van een cryostaat en bewaar de dia's bij min 25 graden Celsius. De radiale gliacel, of RGC, proliferatie in het hersenweefsel van zebravissen werd geëvalueerd.De meeste RGC's waren prolifererend celantigeen negatief in de contralaterale niet-gewonde hemisfeer. Twee dagen na het letsel werd RGC-proliferatie geïnduceerd aan de gewonde kant van het medaka-tectum. Na het hersenletsel werden celafstamming en RGC-differentiatie geëvalueerd met bromodeoxyuridine, of BrdU, labeling.De representatieve analyse toont pasgeboren neuronen zeven dagen na het letsel in de gewonde zebravis en medaka. Een van de kritieke stappen bij steekwondverwondingen is het handmatig inbrengen van naalden. Een consistente blessure is noodzakelijk voor het creëren van reproduceerbare resultaten.Fluorescerende kleurstoffen zijn effectief als wondmarkers. De mate van fluorescerende kleurstofdiffusie geeft de locatie en diepte van het steekwondletsel aan. Deze techniek is mogelijk aangepast aan andere kleine vissoorten en aanpassing aan medaka maakt vergelijkingen van regeneratief vermogen mogelijk.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nier Regeneratie in Adult zebravis door Gentamicin geïnduceerd letsel

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse van de zebravis Larven skeletspieren Integriteit met Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Zoutgehalte-afhankelijke toxiciteit Test van Silver nanocolloïden gebruik van Medaka Eieren

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolatie en uitbreiding van Adult Canine hippocampus Neural Voorlopers

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo beeldvorming van transgene Gene Expression Individuele retinale voorouders in chimère zebravis embryo&#39;s to Cell Nonautonomous Invloeden Studie

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Volwassen Zebrafish letsel modellen te bestuderen van de effecten van prednisolon in het herstel van botweefsel

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisatie van tangentiële cel migratie in de ontwikkelingslanden Chick Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

De opkomende ruimtelijke ordening van zoogdiercellen in kaart brengen met behulp van micro patronen en kwantitatieve beeldvorming

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...