Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 et 21K15195 et une subvention interne de AIST, Japon.

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Le poisson zèbre et le médaka ont été entretenus conformément aux procédures standard28.
1. Blessure par arme blanche dans le tectum optique de l’adulte
<ol><li>Préparer une solution mère de tricaïne à 0,4 % (p/v) pour l’anesthésie. Pour une solu...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Ici, un ensemble de méthodes est décrit qui peut être utilisé pour induire des blessures par arme blanche dans le tectum optique en utilisant une aiguille pour faciliter l’évaluation de la prolifération et de la différenciation du RGC après une lésion cérébrale. Les coups de couteau médiés par aiguille sont une méthode simple et efficacement mise en œuvre qui peut être appliquée à de nombreux échantillons expérimentaux à l’aide d’un ensemble standard d’outils. Des modèles de blessures par ar...

Le poisson zèbre (Danio rerio) a une capacité accrue à régénérer son système nerveux central (SNC) par rapport aux autres mammifères 1,2,3. Récemment, pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette capacité de régénération accrue, des analyses comparatives de la régénération tissulaire à l’aide de la technologie de séquençage de nouvelle génération ont été effectuées 4,5,6. Les structures cérébrales du poisson zèbre et des tétrapodes sont très différentes 7,8,9. Cela signifie que plusieurs modèles de lésions cérébrales utilisant de petits poissons ayant des structures cérébrales et des caractéristiques biologiques similaires ont été développés pour faciliter l’étude des mécanismes moléculaires sous-jacents contribuant à cette capacité de régénération accrue.
En outre, le médaka (Oryzias latipes) est un animal de laboratoire populaire avec une faible capacité de régénération cardiaque et neuronale10,11,12,13 par rapport au poisson zèbre. Le poisson-zèbre et le medaka ont des structures cérébrales et des niches similaires pour les cellules souches neurales adultes (CSN)14,15,16,17. Chez le poisson-zèbre et le médaka, le tectum optique comprend deux types de CSN, les cellules souches de type neuroépithélial et les cellules gliales radiales (CGR)15,18. Une blessure par arme blanche pour le tectum optique du poisson-zèbre adulte a déjà été développée, et ce modèle a été utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires régulant la régénération cérébrale chez ces animaux 19,20,21,22,23. Ce modèle de blessure par arme blanche chez le poisson zèbre jeune adulte a induit une neurogenèse régénérative à partir des CGR 19,24,25. Cette blessure par arme blanche dans le tectum optique est une méthode robuste et reproductible 13,19,20,21,22,23,24,25. Lorsque le même modèle de blessure a été appliqué au médaka adulte, la faible capacité neurogène des CGR dans le tectum optique medaka a été révélée par l’analyse comparative de la prolifération et de la différenciation des CGR après une blessure13.
Des modèles de blessures par arme blanche dans le tectum optique ont également été développés dans les modèles de porc mummichog26, mais les détails de la lésion tectum n’ont pas été bien documentés par rapport aux lésions télencéphaliques27. La blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide de poisson zèbre et de médaka permet d’étudier les réponses cellulaires différentielles et l’expression génique entre les espèces ayant une capacité de régénération différentielle. Ce protocole décrit comment effectuer une blessure par arme blanche dans le tectum optique à l’aide d’une aiguille d’injection. Cette méthode peut être appliquée aux petits poissons comme le poisson zèbre et le medaka. Les processus de préparation des échantillons pour l’analyse histologique et l’analyse de prolifération et de différenciation cellulaire à l’aide de l’immunohistochimie fluorescente et des cryosections sont expliqués ici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Alors que le poisson zèbre a une capacité supérieure à régénérer son système nerveux central (SNC), le médaka a une capacité de régénération du SNC inférieure. Un modèle de lésion cérébrale a été développé dans le tectum optique adulte du poisson zèbre et du médaka et des analyses histologiques et moléculaires comparatives ont été effectuées pour élucider les mécanismes moléculaires régulant la capacité de régénération élevée de ce tissu chez ces espèces de poissons. Ici, un modèle de blessure par arme blanche est présenté pour le tectum optique adulte à l’aide d’une aiguille et d’analyses histologiques pour la prolifération et la différenciation des cellules souches neurales (CSN). Une aiguille a été insérée manuellement dans la région centrale du tectum optique, puis les poissons ont été perfusés par voie intracardiale, et leur cerveau a été disséqué. Ces tissus ont ensuite été cryosectionnés et évalués à l’aide d’immunomarquage contre les marqueurs appropriés de prolifération et de différenciation des CSN. Ce modèle de lésion tectum fournit des résultats robustes et reproductibles chez le poisson-zèbre et le médaka, ce qui permet de comparer les réponses aux CSN après une blessure. Cette méthode est disponible pour les petits téléostéens, y compris le poisson zèbre, le médaka et le killifish africain, et nous permet de comparer leur capacité de régénération et d’étudier des mécanismes moléculaires uniques.

Les blessures causées par un coup de couteau dans le tectum optique à l’aide de l’insertion d’une aiguille dans l’hémisphère droit (figure 1, figure 4A et figure 5A) induisent diverses réponses cellulaires, y compris la prolifération des cellules gliales radiales (CGR) et la génération de neurones nouveau-nés. De même, des populations âgées de poissons-zèbres et de médakas ont été utilisées pour contrer les ...

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Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Un modèle de lésion cérébrale mécanique chez le poisson-zèbre adulte est décrit pour étudier les mécanismes moléculaires régulant leur capacité de régénération élevée. La méthode explique de créer une blessure par arme blanche dans le tectum optique de plusieurs espèces de petits poissons afin d’évaluer les réponses régénératives à l’aide d’immunomarquage fluorescent.

Modèle de blessure par arme blanche du tectum optique adulte à l’aide de poisson-zèbre et de Medaka pour l’analyse comparative de la capacité de régénération

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

La blessure par arme blanche est une méthode de blessure mécanique qui induit une ablation cellulaire non spécifique. Cette méthode facilite l’évaluation de la prolifération et de la différenciation du CGR après une lésion cérébrale. Les blessures par arme blanche médiées par une aiguille sont une méthode simple et efficacement mise en œuvre pour induire une lésion cérébrale.Cette méthode peut être appliquée à de nombreux échantillons expérimentaux à l’aide d’un ensemble standard d’outils. La capacité de régénération du poisson zèbre a été illustrée à l’aide du modèle des blessures par arme blanche. De nouvelles connaissances sur le mécanisme moléculaire régulant la régénération neuronale contribuent à la thérapie régénérative dans le système nerveux central.Commencez par placer un poisson-zèbre adulte anesthésié ou un medaka sur un plateau en polystyrène. Fixez le poisson à la verticale entre deux aiguilles de calibre 30 insérées verticalement dans la mousse de polystyrène. Tenez le corps du poisson pour empêcher la tête du poisson de bouger, puis insérez verticalement une aiguille de calibre 30 à travers le crâne dans la région médiale de l’une des sphères du tectum optique.Ensuite, transférez le poisson blessé dans un aquarium avec de l’eau fraîche de l’installation de poisson. Une fois que les poissons se sont complètement remis de l’anesthésie, déplacez le réservoir vers le système de reproduction. Mettez des serviettes en papier sur le plateau en polystyrène expansé pour placer le poisson anesthésié.Ensuite, maintenez le corps du poisson en place en insérant verticalement deux aiguilles de calibre 30 de chaque côté de la nageoire anale. Une fois le poisson placé, faites une incision ventrale de l’anus au cœur. Gardez le cœur visible en insérant deux aiguilles de calibre 30 de chaque côté.Utilisez ensuite la pointe de la pince pour enlever la couche épithéliale argentée. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans le ventricule, en maintenant le biseau, et faites une incision dans l’oreillette à l’aide de la pince. Ensuite, poussez le PBS dans l’oreillette en appuyant sur la seringue pour évacuer le sang de l’oreillette.Lorsque le sang est drainé et que les branchies deviennent blanches, arrêtez la perfusion PBS. Plus tard, retirez les aiguilles fixant le corps du poisson en place et fixez le côté ventral du poisson vers le bas. Après avoir coupé la moelle épinière et retiré le crâne du tectum optique et du télencéphale, coupez les nerfs optiques et disséquez le cerveau.Ensuite, transférez les cerveaux dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS, pour fixer pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir lavé les cerveaux fixes trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacun, transférez les cerveaux dans des tubes de 1,5 millilitre avec un millilitre de saccharose à 30% en poids en volume dans du PBS comme cryoprotecteur, et incuberez-les pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Préparez le composé d’enrobage en combinant 30% de saccharose avec 30 millilitres de composé à température de coupe optimale, ou OCT, et stockez le composé à quatre degrés Celsius.Pour refroidir le cryomoule une fois, incuber un bloc d’aluminium pendant la nuit à moins 80 degrés Celsius, et mettre le bloc pré-refroidi dans une boîte en polystyrène avec un couvercle pour éviter le réchauffement. Pour les coupes coronales, intégrez le cerveau disséqué dans un cryomoule en ajustant l’orientation à l’aide d’une pince au microscope. Ensuite, placez le cryomoule sur le bloc d’aluminium prérefroidi dans la boîte en polystyrène expansé et laissez le composé OCT geler et devenir blanc.Lorsque le composé gèle, appliquez un petit cercle de composé OCT sur un disque d’échantillon avant de monter le cryobloc sur le disque de l’échantillon. En plaçant le disque de l’échantillon dans le cryostat, congeler le composé OCT. Placez ensuite le disque de l’échantillon sur la tête de l’échantillon dans le cryostat.Après avoir défini l’orientation du cryobloc, coupez l’OCT pour supprimer toutes les régions supplémentaires. Découpez des sections en série de 14 micromètres d’épaisseur à travers tout le tectum optique à l’aide d’un cryostat et stockez les lames à moins 25 degrés Celsius. La prolifération des cellules gliales radiales, ou RGC, dans le tissu cérébral du poisson zèbre a été évaluée.La plupart des CGR proliféraient de l’antigène cellulaire négatif dans l’hémisphère controlatéral non blessé. Deux jours après la blessure, la prolifération du CGR a été induite du côté blessé du tectum medaka. Après la lésion cérébrale, la lignée cellulaire et la différenciation du CGR ont été évaluées avec le marquage de la bromodésoxyuridine, ou BrdU.L’analyse représentative montre les neurones nouveau-nés sept jours après la blessure chez le poisson-zèbre blessé et le medaka. L’une des étapes critiques des blessures par arme blanche est l’insertion manuelle de l’aiguille. Une blessure constante est nécessaire pour créer des résultats reproductibles.Les colorants fluorescents sont efficaces comme marqueurs de plaie. L’étendue de la diffusion du colorant fluorescent indique l’emplacement et la profondeur de la blessure par arme blanche. Cette technique est potentiellement adaptée à d’autres espèces de petits poissons, et l’adaptation au medaka permet de comparer la capacité de régénération.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Régénération rénale à l&#39;âge adulte poisson zèbre par gentamicine blessures induites

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinity dépendant Essai de toxicité de l&#39;argent nanocolloïdes Utilisation de Medaka Eggs

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolement et expansion des adultes Canine hippocampiques Neural Précurseurs

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Imagerie in vivo de Transgenic Gene Expression en Retinal individuelle progéniteurs dans chimériques Zebrafish Embryons à étudier cellulaires Influences non autonomes

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A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

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Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Modèles de lésion du poisson-zèbre adulte pour étudier les effets de la Prednisolone dans la régénération de tissu osseux

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Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Cartographier l'organisation spatiale émergente des cellules mammifères à l'aide de micromodèles et d'imagerie quantitative

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...