Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
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Diese Arbeit wurde durch die JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 und 21K15195 sowie ein internes Stipendium des AIST, Japan, unterstützt.

Alle Versuchsprotokolle wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee am National Institute of Advanced Industrial Science and Technology genehmigt. Zebrafische und Medaka wurden nach Standardverfahren gehalten28.
1. Stichwundenverletzung im erwachsenen optischen Tectum
<ol><li>Bereiten Sie eine 0,4% (w/v) Tricain-Stammlösung für die Anästhesie vor. Für eine 100-ml-Stammlösung werden 400 mg Tricainmethansulfonat (siehe Materialta...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Hier wird eine Reihe von Methoden beschrieben, die verwendet werden können, um Stichwundverletzungen im optischen Tectum unter Verwendung einer Nadel zu induzieren, um die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach einer Hirnverletzung zu erleichtern. Nadelvermittelte Stichwunden sind eine einfache, effizient implementierte Methode, die mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden kann. Es wurden Stichwundenmodelle für verschiedene Regionen des Zebrafischgehir...

Zebrafische (Danio rerio) haben im Vergleich zu anderen Säugetieren eine erhöhte Fähigkeit, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren 1,2,3. Um die molekularen Mechanismen, die dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit zugrunde liegen, besser zu verstehen, wurden kürzlich vergleichende Analysen der Geweberegeneration mit Next-Generation-Sequencing-Technologie durchgeführt 4,5,6. Die Gehirnstrukturen bei Zebrafischen und Tetrapoden sind sehr unterschiedlich 7,8,9. Dies bedeutet, dass mehrere Hirnverletzungsmodelle mit kleinen Fischen mit ähnlichen Gehirnstrukturen und biologischen Merkmalen entwickelt wurden, um die Untersuchung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu erleichtern, die zu dieser erhöhten Regenerationsfähigkeit beitragen.
Darüber hinaus ist Medaka (Oryzias latipes) ein beliebtes Labortier mit einer geringen Kapazität für die Herz- und neuronale Regeneration10,11,12,13 im Vergleich zu Zebrafischen. Zebrafische und Medaka haben ähnliche Gehirnstrukturen und Nischen für adulte neurale Stammzellen (NSCs)14,15,16,17. Im Zebrafisch und in der Medaka umfasst das optische Tectum zwei Arten von NSCs, neuroepithelähnliche Stammzellen und radiale Gliazellen (RGCs)15,18. Eine Stichwundenverletzung für das optische Tectum von erwachsenen Zebrafischen wurde zuvor entwickelt, und dieses Modell wurde verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Gehirnregeneration bei diesen Tieren regulieren 19,20,21,22,23. Dieses junge, erwachsene Zebrafisch-Stichverletzungsmodell induzierte eine regenerative Neurogenese aus RGCs 19,24,25. Diese Stichwundenverletzung im optischen Tectum ist eine robuste und reproduzierbare Methode 13,19,20,21,22,23,24,25. Wenn das gleiche Verletzungsmodell auf adulte Medaka angewendet wurde, wurde die geringe neurogene Kapazität von RGCs im Medaka Optic Tectum durch die vergleichende Analyse der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach der Verletzung13 aufgedeckt.
Stichwundenverletzungsmodelle im optischen Tectum wurden auch in Mummichog-Modellen26 entwickelt, aber Details der Tectumverletzung wurden im Vergleich zur telenzephalen Verletzung27 nicht gut dokumentiert. Die Stichwundenverletzung im optischen Tectum mit Zebrafisch und Medaka ermöglicht die Untersuchung der differentiellen zellulären Reaktionen und der Genexpression zwischen Arten mit unterschiedlicher Regenerationsfähigkeit. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Stichwunde im optischen Tectum mit einer Injektionsnadel durchgeführt wird. Diese Methode kann auf kleine Fische wie Zebrafische und Medaka angewendet werden. Die Verfahren zur Probenvorbereitung für die histologische Analyse und die zelluläre Proliferations- und Differenzierungsanalyse mittels fluoreszierender Immunhistochemie und Kryosektionen werden hier erläutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Während Zebrafische eine überlegene Fähigkeit haben, ihr zentrales Nervensystem (ZNS) zu regenerieren, hat Medaka eine geringere ZNS-Regenerationsfähigkeit. Es wurde ein Hirnverletzungsmodell im adulten optischen Tectum von Zebrafischen und Medaka entwickelt und vergleichende histologische und molekulare Analysen wurden durchgeführt, um die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die hohe Regenerationsfähigkeit dieses Gewebes bei diesen Fischarten regulieren. Hier wird ein Stichwundenmodell für das adulte optische Tectum unter Verwendung einer Nadel und histologischer Analysen zur Proliferation und Differenzierung der neuralen Stammzellen (NSCs) vorgestellt. Eine Nadel wurde manuell in den zentralen Bereich des optischen Tectums eingeführt, und dann wurden die Fische intrakardial perfundiert und ihre Gehirne wurden seziert. Diese Gewebe wurden dann kryosektioniert und mittels Immunfärbung gegen die entsprechenden NSC-Proliferations- und Differenzierungsmarker bewertet. Dieses Tectum-Verletzungsmodell liefert robuste und reproduzierbare Ergebnisse sowohl bei Zebrafischen als auch bei Medaka, so dass die NSC-Reaktionen nach einer Verletzung verglichen werden können. Diese Methode ist für kleine Teleosten wie Zebrafische, Medaka und afrikanische Killifische verfügbar und ermöglicht es uns, ihre Regenerationsfähigkeit zu vergleichen und einzigartige molekulare Mechanismen zu untersuchen.

Eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum durch Einführen der Nadel in die rechte Hemisphäre (Abbildung 1, Abbildung 4A und Abbildung 5A) induziert verschiedene zelluläre Reaktionen, einschließlich der Proliferation radialer Gliazellen (RGC) und der Bildung neugeborener Neuronen. In ähnlicher Weise wurden gealterte Populationen von Zebrafischen und Medaka verwendet, um Alterungseffekten in der regenerativen Reaktion entgeg...

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Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Ein mechanisches Hirnverletzungsmodell im erwachsenen Zebrafisch wird beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die ihre hohe Regenerationsfähigkeit regulieren. Die Methode erklärt, wie eine Stichwundenverletzung im optischen Tectum mehrerer Arten kleiner Fische erzeugt wird, um die regenerativen Reaktionen mittels fluoreszierender Immunfärbung zu bewerten.

Stichwundenverletzungsmodell des adulten optischen Tektums unter Verwendung von Zebrafisch und Medaka zur vergleichenden Analyse der Regenerationsfähigkeit

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Die Stichwundenverletzung ist eine mechanische Verletzungsmethode, die eine unspezifische Zellablation induziert. Diese Methode erleichtert die Beurteilung der RGC-Proliferation und -Differenzierung nach Hirnverletzungen. Nadelvermittelte Stichwundenverletzungen sind eine einfache, effizient implementierte Methode, um eine Hirnverletzung zu induzieren.Diese Methode kann mit einem Standardsatz von Werkzeugen auf viele experimentelle Proben angewendet werden. Die Regenerationsfähigkeit von Zebrafischen wurde anhand des Stichwundenmodells veranschaulicht. Neue Erkenntnisse über molekulare Mechanismen, die die neuronale Regeneration regulieren, tragen zur regenerativen Therapie im zentralen Nervensystem bei.Beginnen Sie damit, einen betäubten erwachsenen Zebrafisch oder Medaka auf eine Styroporschale zu legen. Befestigen Sie den Fisch aufrecht zwischen zwei 30-Gauge-Nadeln, die senkrecht in das Styropor eingeführt werden. Halten Sie den Fischkörper fest, um zu verhindern, dass sich der Fischkopf bewegt, und führen Sie dann vertikal eine 30-Gauge-Nadel durch den Schädel in den medialen Bereich einer der optischen Tectumkugeln ein.Als nächstes überführen Sie die verletzten Fische in ein Aquarium mit frischem Fischanlagenwasser. Sobald sich die Fische vollständig von der Anästhesie erholt haben, stellen Sie den Tank in das Zuchtsystem. Legen Sie Papiertücher auf die Styroporschale, um den betäubten Fisch zu platzieren.Halten Sie dann den Fischkörper an Ort und Stelle, indem Sie zwei 30-Gauge-Nadeln auf beiden Seiten der Afterflosse vertikal einführen. Sobald der Fisch platziert ist, machen Sie einen ventralen Einschnitt vom Anus zum Herzen. Halten Sie das Herz sichtbar, indem Sie auf jeder Seite zwei 30-Gauge-Nadeln einführen.Verwenden Sie dann die Spitze der Pinzette, um die Silberepithelschicht zu entfernen. Führen Sie die 30-Gauge-Nadel in den Ventrikel ein, halten Sie die Fase oben und machen Sie mit der Pinzette einen Einschnitt in den Vorhof. Als nächstes drücken Sie PBS in den Vorhof, indem Sie auf die Spritze drücken, um das Blut aus dem Vorhof zu spülen.Wenn das Blut abgelassen wird und die Kiemen weiß werden, stoppen Sie die PBS-Perfusion. Entfernen Sie später die Nadeln, mit denen der Fischkörper befestigt ist, und befestigen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten. Nachdem Sie das Rückenmark durchtrennt und den Schädel aus dem optischen Tectum und Telencephalon entfernt haben, schneiden Sie die Sehnerven durch und sezieren Sie das Gehirn.Als nächstes wird das Gehirn in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter 4% Paraformaldehyd in PBS überführt, um es über Nacht bei vier Grad Celsius zu fixieren. Nachdem Sie die fixierten Gehirne dreimal fünf Minuten lang in PBS gewaschen haben, werden die Gehirne in 1,5-Milliliter-Röhrchen mit einem Milliliter Saccharose von 30 Volumenprozent in PBS als Kryoprotektivum überführt und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubiert. Bereiten Sie die Einbettmasse vor, indem Sie 30% Saccharose mit 30 Millilitern optimaler Schnitttemperatur (OCT) kombinieren, und lagern Sie die Verbindung bei vier Grad Celsius.Um den Kryomold einmal abzukühlen, inkubieren Sie einen Aluminiumblock über Nacht bei minus 80 Grad Celsius und legen Sie den vorgekühlten Block in eine Styroporbox mit Deckel, um eine Erwärmung zu verhindern. Für koronale Schnitte betten Sie das präparierte Gehirn in einen Kryomold ein, indem Sie die Orientierung mit einer Pinzette unter dem Mikroskop anpassen. Als nächstes legen Sie den Kryomold auf den vorgekühlten Aluminiumblock in der Styroporbox und lassen Sie die OCT-Verbindung gefrieren und weiß werden.Wenn die Verbindung gefriert, tragen Sie einen kleinen Kreis OCT-Verbindung auf eine Probenscheibe auf, bevor Sie den Kryoblock auf die Probenscheibe montieren. Durch Einsetzen der Probenscheibe in den Kryostaten frieren Sie die OCT-Verbindung ein. Legen Sie dann die Probenscheibe auf den Probenkopf im Kryostat.Nachdem Sie die Ausrichtung des Kryoblocks festgelegt haben, schneiden Sie das OAT ab, um zusätzliche Bereiche zu entfernen. Schneiden Sie 14 Mikrometer dicke Serienschnitte mit einem Kryostaten durch das gesamte optische Tectum und lagern Sie die Objektträger bei minus 25 Grad Celsius. Die radiale Gliazellproliferation (RGC) im Hirngewebe von Zebrafischen wurde untersucht.Die meisten RGCs waren in der kontralateralen unverletzten Hemisphäre proliferierend Zellantigen-negativ. Zwei Tage nach der Verletzung wurde eine RGC-Proliferation auf der verletzten Seite des Medaka-Tectums induziert. Nach der Hirnverletzung wurden die Zelllinie und die RGC-Differenzierung mit Bromdesoxyuridin- oder BrdU-Markierung bewertet.Die repräsentative Analyse zeigt neugeborene Neuronen sieben Tage nach der Verletzung bei den verletzten Zebrafischen und Medaka. Einer der entscheidenden Schritte bei Stichwunden ist das manuelle Einführen der Nadel. Eine konsistente Verletzung ist notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.Fluoreszenzfarbstoffe sind als Wundmarker wirksam. Das Ausmaß der Fluoreszenzfarbstoffdiffusion gibt den Ort und die Tiefe der Stichwunde an. Diese Technik ist potenziell an andere kleine Fischarten angepasst, und die Anpassung an Medaka ermöglicht Vergleiche der Regenerationsfähigkeit.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Nieren-Regeneration im erwachsenen Zebrafisch durch Gentamicin induzierte Schädigung

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salinität abhängigen Toxizität Assay von Silbernanokolloide Verwendung von Medaka-Eier

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolierung und Expansion von adulten Canine Hippocampus Neural Precursors

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Eine Seminiferous Röhrchen-Squash-Technik für die zytologische Analyse der Spermatogenese mit dem Maus-Modell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Erwachsenen Zebrafisch Verletzungen Modelle zur Untersuchung der Auswirkungen von Prednisolon bei der Regeneration von Knochengewebe

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisierung der tangentialen Zellwanderung in den Entwicklungsländern Küken Optic Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kartierung der Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells mit Mikromustern und quantitativer Bildgebung

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...