Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי JSPS KAKENHI מענק מספר 18K14824 ו 21K15195 ומענק פנימי של AIST, יפן.

כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים במכון הלאומי למדע וטכנולוגיה תעשייתיים מתקדמים. דגי זברה ומדאקה נשמרו על פי נהלים סטנדרטיים28.
1. פצע דקירה בטקטום האופטי למבוגרים
<ol><li>הכינו תמיסת מלאי טריקאין של 0.4% (w/v) להרדמה. ?...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

כאן מתוארת קבוצה של שיטות שניתן להשתמש בהן כדי לגרום לפציעות פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט כדי להקל על הערכת התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פצעי דקירה בתיווך מחט הם שיטה פשוטה ויעילה המיושמת שניתן ליישם על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות סט כלים סטנדרטי. מודלים של פגיעה בפצעי ?...

לדגי זברה (Danio rerio) יש יכולת מוגברת לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) בהשוואה ליונקים אחרים 1,2,3. לאחרונה, כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס יכולת התחדשות מוגברת זו, בוצעו ניתוחים השוואתיים של התחדשות רקמות באמצעות טכנולוגיית ריצוף הדור הבא 4,5,6. מבני המוח בדגי זברה וטטרפודים שונים למדי 7,8,9. משמעות הדבר היא שמספר מודלים של פגיעות מוחיות המשתמשים בדגים קטנים עם מבני מוח דומים ומאפיינים ביולוגיים דומים פותחו כדי להקל על חקירת המנגנונים המולקולריים הבסיסיים התורמים ליכולת התחדשות מוגברת זו.
בנוסף, מדאקה (Oryzias latipes) היא חיית מעבדה פופולרית עם יכולת נמוכה להתחדשות לב ועצב10,11,12,13 בהשוואה לדגי זברה. לדגי זברה ולמדקה יש מבני מוח ונישות דומים עבור תאי גזע עצביים בוגרים (NSCs)14,15,16,17. בדגי זברה ובמדאקה, הטקטום האופטי כולל שני סוגים של תאי גזע גזעיים דמויי נוירואפיתל ותאי גליה רדיאליים (RGCs)15,18. בעבר פותחה פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של דגי זברה בוגרים, ומודל זה שימש לחקר המנגנונים המולקולריים המווסתים את התחדשות המוח בבעלי חיים אלה 19,20,21,22,23. מודל פציעת פצע דקירה של דג זברה בוגר צעיר זה גרם לנוירוגנזה רגנרטיבית מ-RGCs 19,24,25. פציעת פצע דקירה זו בטקטום האופטי היא שיטה חזקה וניתנת לשחזור 13,19,20,21,22,23,24,25. כאשר אותו מודל פציעה יושם על מדאקה בוגרת, היכולת הנוירוגנית הנמוכה של RGCs בטקטום האופטי של מדאקה התגלתה באמצעות ניתוח השוואתי של התפשטות והתמיינות RGC לאחר פציעה13.
מודלים של פגיעות פצע דקירה בטקטום האופטי פותחו גם במודלים של מומיצ'וג26, אך פרטים על פגיעת הטקטום לא תועדו היטב בהשוואה לפגיעה טלנצפלית27. פציעת פצע הדקירה בטקטום האופטי באמצעות דגי זברה ומדאקה מאפשרת לחקור את התגובות התאיות הדיפרנציאליות ואת ביטוי הגנים בין מינים בעלי יכולת התחדשות דיפרנציאלית. פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע פגיעה בפצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות מחט הזרקה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגים קטנים כמו דגי זברה ו medaka. התהליכים להכנת דגימות לניתוח היסטולוגי וניתוח התפשטות והתמיינות תאים באמצעות אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית והקפאה מוסברים כאן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

בעוד שלדגי זברה יש יכולת מעולה לחדש את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS), למדאקה יש יכולת התחדשות CNS נמוכה יותר. מודל של פגיעה מוחית פותח בטקטום האופטי הבוגר של דגי זברה ומדאקה ובוצעו ניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים השוואתיים כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה של רקמה זו על פני מיני דגים אלה. כאן מוצג מודל פגיעה בפצע דקירה עבור טקטום אופטי בוגר באמצעות מחט וניתוחים היסטולוגיים להתרבות והתמיינות של תאי גזע עצביים (NSCs). מחט הוחדרה ידנית לאזור המרכזי של הטקטום האופטי, ואז הדגים היו מחוררים תוך לב, ומוחם נותח. רקמות אלה הוקפאו והוערכו באמצעות אימונוסטיין כנגד סמני ההתפשטות וההתמיינות המתאימים של NSC. מודל פגיעות טקטום זה מספק תוצאות חזקות וניתנות לשחזור הן בדגי זברה והן במדאקה, ומאפשר להשוות את תגובות המל"ל לאחר פציעה. שיטה זו זמינה לטלאוסטים קטנים, כולל דגי זברה, מדאקה וקיליפיש אפריקאי, ומאפשרת לנו להשוות את יכולת ההתחדשות שלהם ולחקור מנגנונים מולקולריים ייחודיים.

פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי באמצעות החדרת מחט להמיספרה הימנית (איור 1, איור 4A ואיור 5A) גורמת לתגובות תאיות שונות, כולל התפשטות תאי גליה רדיאליים (RGC) ויצירת תאי עצב שזה עתה נולדו. באופן דומה, אוכלוסיות מבוגרות של דגי זברה ומדאקה שימשו כדי לנט...

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

מודל מכני של פגיעה מוחית בדגי זברה בוגרים מתואר כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים המווסתים את יכולת ההתחדשות הגבוהה שלהם. השיטה מסבירה יצירת פציעת פצע דקירה בטקטום האופטי של מינים רבים של דגים קטנים כדי להעריך את התגובות הרגנרטיביות באמצעות אימונוסטיישן פלואורסצנטי.

מודל פציעת פצע דקירה של הטקטום האופטי הבוגר באמצעות דגי זברה ומדאקה לניתוח השוואתי של יכולת התחדשות

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

פציעת פצע דקירה היא שיטת פציעה מכנית הגורמת לאבלציה של תאים לא ספציפיים. שיטה זו מאפשרת הערכה של התפשטות RGC והתמיינות לאחר פגיעה מוחית. פגיעה בפצע דקירה בתיווך מחט היא שיטה פשוטה ויעילה לגרימת פגיעה מוחית.שיטה זו יכולה להיות מיושמת על דגימות ניסיוניות רבות באמצעות קבוצה סטנדרטית של כלים. יכולת ההתחדשות של דגי הזברה הודגמה באמצעות מודל פציעת פצע דקירה. תובנות חדשות על מנגנון מולקולרי המווסת התחדשות עצבית תורמות לטיפול רגנרטיבי במערכת העצבים המרכזית.התחילו בהנחת דג זברה בוגר מורדם או מדאקה על מגש קלקר. מקבעים את הדג זקוף בין שתי מחטים של 30 מד המוחדרות אנכית לתוך הקלקר. החזיקו את גוף הדג כדי למנוע מראש הדג לזוז, ולאחר מכן הכניסו אנכית מחט של 30 מד דרך הגולגולת לאזור המדיאלי של אחד מכדורי הטקטום האופטי.לאחר מכן, העבירו את הדגים הפצועים למיכל דגים עם מי מתקן דגים טריים. לאחר שהדגים התאוששו לחלוטין מההרדמה, העבירו את המיכל למערכת הרבייה. הניחו מגבות נייר על מגש הקלקר כדי להניח את הדג המורדם.לאחר מכן החזיקו את גוף הדג במקומו על ידי החדרה אנכית של שתי מחטים של 30 מד משני צדי סנפיר פי הטבעת. לאחר הצבת הדג, בצע חתך גחוני מפי הטבעת אל הלב. שמור על הלב גלוי על ידי החדרת שתי מחטים של 30 מד בכל צד.לאחר מכן השתמש בקצה המלקחיים כדי להסיר את שכבת האפיתל הכסופה. הכנס את המחט 30 מד לתוך החדר, שמירה על השיפוע למעלה, ולעשות חתך לתוך אטריום באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, לדחוף PBS לתוך האטריום על ידי לחיצה על המזרק כדי לשטוף את הדם מן האטריום.כאשר הדם מנוקז והזימים הופכים לבנים, הפסיקו את הזלוף של PBS. מאוחר יותר, הסירו את המחטים המקבעות את גוף הדג במקומו, וקיבעו את הצד הגחוני של הדג כלפי מטה. לאחר חיתוך חוט השדרה והסרת הגולגולת מהטקטום האופטי והטלנספלון, חתכו את עצבי הראייה ונתחו את המוח.לאחר מכן, העבירו את המוח לצינורות של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS, כדי לתקן בן לילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר שטיפת המוחות הקבועים שלוש פעמים ב-PBS במשך חמש דקות כל אחת, העבירו את המוחות לצינורות של 1.5 מיליליטר עם מיליליטר אחד במשקל של 30% בנפח סוכרוז ב-PBS כחומר הגנה קריופרוטקטיבי, ודגרו עליהם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. הכינו את תרכובת ההטבעה על ידי שילוב של 30% סוכרוז עם 30 מיליליטר של טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, תרכובת, ואחסנו את התרכובת בארבע מעלות צלזיוס.כדי לקרר את הקריומולד פעם אחת, דגרו על בלוק אלומיניום למשך הלילה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס, והכניסו את הבלוק המקורר מראש לקופסת קלקר עם מכסה למניעת התחממות. עבור קטעי העטרה, הטמע את המוח המנותח בקריומולד על ידי התאמת הכיוון באמצעות מלקחיים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן, הניחו את הקריומולד על בלוק האלומיניום המקורר מראש בקופסת הקלקר, ואפשרו לתרכובת OCT לקפוא ולהפוך ללבנה.כאשר התרכובת קופאת, יש למרוח עיגול קטן של תרכובת OCT על דיסק דגימה לפני הרכבת הקריובלוק על דיסק הדגימה. על ידי הנחת דיסק הדגימה בהקפאה, להקפיא את תרכובת OCT. לאחר מכן הניחו את דיסק הדגימה על ראש הדגימה בהקפאה.לאחר הגדרת הכיוון של cryoblock, לחתוך את OCT כדי להסיר אזורים מיותרים. חתכו מקטעים טוריים בעובי 14 מיקרומטר דרך כל הטקטום האופטי באמצעות קריוסטט, ואחסנו את המגלשות במינוס 25 מעלות צלזיוס. התא הגליה הרדיאלי, או RGC, התפשטות ברקמת המוח של דגי זברה הוערכה.רוב ה-RGCs התרבו אנטיגן תאי שלילי בהמיספרה הנגדית שלא נפגעה. יומיים לאחר הפציעה, התפשטות RGC נגרמה בצד הפגוע של טקטום המדאקה. לאחר הפגיעה המוחית, שושלת התאים והתמיינות RGC הוערכו באמצעות תיוג ברומודוקסיורידין, או BrdU.הניתוח המייצג מראה נוירונים שזה עתה נולדו שבעה ימים לאחר הפציעה בדגי הזברה הפגועים ובמדאקה. אחד השלבים הקריטיים בפציעות מפצעי דקירה הוא החדרת מחט ידנית. פציעה עקבית נחוצה ליצירת תוצאות הניתנות לשחזור.צבעים פלואורסצנטיים יעילים כסמני פצע. מידת פיזור הצבע הפלואורסצנטי מצביעה על מיקום ועומק פצע הדקירה. טכניקה זו מותאמת פוטנציאלית למיני דגים קטנים אחרים, והסתגלות למדאקה מאפשרת השוואה של יכולת התחדשות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

התחדשות בכליות למבוגרי דג הזברה על ידי גנטמיצין מושרה פגיעה

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

מליחות תלויות Assay הרעילה של הכסף Nanocolloids שימוש Medaka ביצים

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

דג זברה בוגרת מודלים פציעה ללמוד את השפעות Prednisolone רגנרציה רקמת העצם

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

ויזואליזציה של נדידת תאים העוסקות ב Tectum אופטיים לפתח הבחורה

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Electroporation Method for In Vivo Delivery of Plasmid DNA in the Adult Zebrafish Telencephalon

שיטת אלקטרופורציה לVivo משלוח של דנ א פלמיד בוגרים בדג טלנצאלון

Electroporation is a transfection method in which an electrical field is applied to cells to create temporary pores in a cell membrane and increase its ...