Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

이 작업은 JSPS KAKENHI 보조금 번호 18K14824 및 21K15195와 일본 AIST의 내부 보조금으로 지원되었습니다.

모든 실험 프로토콜은 국립 산업 기술 종합 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 제브라피쉬와 메다카는 표준 절차28에 따라 유지되었다.
1. 성인 시신경의 찔린 상처 부상
<ol><li>마취를 위해 0.4%(w/v) 트리카인 원액을 준비합니다. 100mL ?...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

여기에서는 뇌 손상 후 RGC 증식 및 분화의 평가를 용이하게 하기 위해 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 유도하는 데 사용할 수 있는 일련의 방법이 설명되어 있습니다. 바늘 매개 찔린 상처는 표준 도구 세트를 사용하여 많은 실험 샘플에 적용할 수 있는 간단하고 효율적으로 구현된 방법입니다. 제브라피쉬 뇌의 여러 영역에 대한 찔린 상처 손상 모델이 개발되었습니다 3...

제브라피쉬(Danio rerio)는 다른 포유류에 비해 중추신경계(CNS)를 재생하는 능력이 증가했다 1,2,3. 최근에, 이러한 증가된 재생 능력의 기초가 되는 분자 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해, 차세대 시퀀싱 기술을 이용한 조직 재생의 비교 분석이 수행되었다 4,5,6. 제브라 피쉬와 테트라포드의 뇌 구조는 상당히 다릅니다 7,8,9. 이것은 유사한 뇌 구조와 생물학적 특징을 가진 작은 물고기를 사용하는 여러 뇌 손상 모델이 이러한 재생 능력 증가에 기여하는 기본 분자 메커니즘의 조사를 용이하게 하기 위해 개발되었음을 의미합니다.
또한, 메다카 (Oryzias latipes)는 제브라 피쉬에 비해 심장 및 신경 재생 능력이 낮은 인기있는 실험실 동물입니다 10,11,12,13. 제브라피쉬와 메다카는 성체 신경 줄기 세포(NSC)에 대해 유사한 뇌 구조와 틈새를 가지고 있습니다.14,15,16,17. 제브라피쉬와 메다카에서 시신경은 두 가지 유형의 NSC, 신경상피 유사 줄기 세포와 방사상 신경교 세포(RGC)를 포함합니다15,18. 성인 제브라피쉬의 시신경에 대한 찔린 상처 손상이 이전에 개발되었으며, 이 모델은 이 동물 19,20,21,22,23에서 뇌 재생을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용되었습니다. 이 젊은 성인 제브라피쉬 찔린 상처 부상 모델은 RGC 19,24,25에서 재생 신경 발생을 유도했습니다. 시신경의 이 찔린 상처는 견고하고 재현 가능한 방법이다 13,19,20,21,22,23,24,25. 동일한 손상 모델을 성인 메다카에 적용했을 때, 메다카 시신경에서 RGC의 낮은 신경원성 능력은 손상 후 RGC 증식 및 분화의 비교 분석을 통해 밝혀졌습니다13.
시신경의 칼에 찔린 상처 손상 모델도 mummichog 모델26에서 개발되었지만, tectum 손상의 세부 사항은 종뇌 손상27과 비교할 때 잘 문서화되지 않았습니다. 제브라피쉬와 메다카를 사용한 시신경의 찔린 상처 손상은 차등 재생 능력을 가진 종 간의 차등 세포 반응과 유전자 발현을 조사할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 주사 바늘을 사용하여 시신경에 찔린 상처 손상을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 제브라피쉬와 메다카와 같은 작은 물고기에 적용할 수 있습니다. 형광 면역조직화학 및 냉동 절편을 사용한 조직학적 분석과 세포 증식 및 분화 분석을 위한 시료 전처리 공정이 여기에 설명되어 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

제브라피쉬는 중추신경계(CNS) 재생 능력이 우수하지만 메다카는 CNS 재생 능력이 낮습니다. 제브라피쉬와 메다카의 성체 시신경에서 뇌 손상 모델을 개발했으며 이러한 어종에 걸쳐 이 조직의 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 밝히기 위해 비교 조직학적 및 분자 분석이 수행되었습니다. 여기에서는 바늘을 사용하여 성인 시신경에 대한 찔린 상처 손상 모델과 신경 줄기 세포(NSC)의 증식 및 분화를 위한 조직학적 분석을 제시합니다. 바늘을 시신경의 중앙 영역에 수동으로 삽입 한 다음 물고기를 심장 내로 관류하고 뇌를 해부했습니다. 이어서, 이들 조직을 냉동 절개하고, 적절한 NSC 증식 및 분화 마커에 대한 면역염색을 사용하여 평가하였다. 이 tectum 손상 모델은 제브라피쉬와 메다카 모두에서 강력하고 재현 가능한 결과를 제공하여 손상 후 NSC 반응을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 제브라피쉬, 메다카, 아프리카 송사리를 포함한 작은 경골에 사용할 수 있으며 재생 능력을 비교하고 고유한 분자 메커니즘을 조사할 수 있습니다.

우반구에 바늘 삽입을 사용하여 시신경의 찔린 상처 손상(그림 1, 그림 4A 및 그림 5A)은 방사상 신경교 세포(RGC) 증식 및 신생아 뉴런 생성을 포함한 다양한 세포 반응을 유도합니다. 유사하게, 제브라피쉬와 메다카의 노화 개체군은 재생 반응에서 노화 효과를 상쇄하는 데 사용되었습니다. 그런 다음 동결 절편에 형광 면역 염색을...

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Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

찔린 상처는 비특이적 세포 절제를 유도하는 기계적 손상 방법입니다. 이 방법은 뇌 손상 후 RGC 증식 및 분화의 평가를 용이하게 합니다. 바늘 매개 찔린 상처 손상은 뇌 손상을 유도하는 간단하고 효율적으로 구현된 방법입니다.이 방법은 표준 도구 세트를 사용하여 많은 실험 샘플에 적용 할 수 있습니다. 제브라피쉬의 재생 능력은 찔린 상처 부상 모델을 사용하여 설명되었습니다. 신경 재생을 조절하는 분자 메커니즘에 대한 새로운 통찰력은 중추 신경계의 재생 치료에 기여합니다.마취 된 성인 제브라 피쉬 또는 메다카를 스티로폼 트레이에 올려 놓는 것으로 시작하십시오. 스티로폼에 수직으로 삽입된 두 개의 30게이지 바늘 사이에 물고기를 똑바로 고정합니다. 물고기 머리가 움직이지 않도록 물고기 몸을 잡고 두개골을 통해 30 게이지 바늘을 시신경 구조 구체 중 하나의 내측 영역에 수직으로 삽입합니다.다음으로, 부상당한 물고기를 신선한 생선 시설 물이 담긴 어항으로 옮깁니다. 물고기가 마취에서 완전히 회복되면 탱크를 번식 시스템으로 옮깁니다. 스티로폼 트레이에 종이 타월을 올려 마취 된 생선을 놓습니다.그런 다음 항문 지느러미의 양쪽에 두 개의 30게이지 바늘을 수직으로 삽입하여 물고기 몸을 제자리에 고정합니다. 물고기가 배치되면 항문에서 심장까지 복부 절개를하십시오. 양쪽에 두 개의 30 게이지 바늘을 삽입하여 심장이 보이도록 합니다.그런 다음 집게의 끝을 사용하여은 상피층을 제거하십시오. 30게이지 바늘을 심실에 삽입하고 경사를 위로 유지하고 집게를 사용하여 심방을 절개합니다. 그런 다음 주사기를 눌러 심방에서 혈액을 씻어내어 PBS를 심방으로 밀어 넣습니다.혈액이 배출되고 아가미가 하얗게 변하면 PBS 관류를 중단하십시오. 나중에 물고기 몸을 제자리에 고정하는 바늘을 제거하고 물고기 복부 쪽을 아래로 고정합니다. 척수를 절단하고 시신경과 종뇌에서 두개골을 제거한 후 시신경을 절단하고 뇌를 해부합니다.다음으로, 뇌를 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드 1 밀리리터가 함유 된 1.5 밀리리터 튜브에 옮겨 섭씨 4도에서 밤새 고정시킵니다. 고정된 뇌를 PBS에서 각각 5분씩 3회 세척한 후 동결방지제로 PBS에 30중량% 자당 1밀리리터를 넣고 1.5밀리리터 튜브에 뇌를 옮기고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 30% 자당과 30밀리리터의 최적 절단 온도 또는 OCT 화합물을 결합하여 임베딩 화합물을 준비하고 섭씨 4도에서 화합물을 보관합니다.cryomold를 한 번 식히려면 섭씨 영하 80도에서 밤새 알루미늄 블록을 배양하고 예냉 된 블록을 뚜껑이 달린 스티로폼 상자에 넣어 따뜻하게합니다. 관상 절편의 경우 현미경으로 집게를 사용하여 방향을 조정하여 해부된 뇌를 극저온 몰드에 삽입합니다. 다음, 스티로폼 상자의 사전 냉각된 알루미늄 블록에 cryomold를 놓고 OCT 화합물이 얼어 흰색이 되도록 합니다.화합물이 얼면 검체 디스크에 극저온 블록을 장착하기 전에 검체 디스크에 작은 원형의 OCT 화합물을 도포합니다. 표본 디스크를 저온 유지 장치에 넣어 OCT 화합물을 동결합니다. 그런 다음 저온 유지 장치의 표본 헤드에 표본 디스크를 놓습니다.크라이오 블록의 방향을 설정한 후 OCT를 트리밍하여 추가 영역을 제거합니다. 저온 유지 장치를 사용하여 전체 시신경을 통해 14마이크로미터 두께의 직렬 섹션을 절단하고 슬라이드를 섭씨 영하 25도에서 보관합니다. 제브라피쉬의 뇌 조직에서 방사형 신경교 세포(RGC) 증식을 평가했습니다.대부분의 RGC는 손상되지 않은 반대쪽 반구에서 음성 세포 항원을 증식시켰습니다. 부상 후 이틀 후, RGC 증식이 medaka tectum의 손상된 쪽에서 유도되었습니다. 뇌 손상 후, 세포 계통 및 RGC 분화는 브로모데옥시유리딘 또는 BrdU 표지로 평가되었습니다.대표적인 분석은 손상된 제브라피쉬와 메다카에서 손상 후 7일째에 신생아 뉴런을 보여줍니다. 찔린 상처 부상의 중요한 단계 중 하나는 수동 바늘 삽입입니다. 재현 가능한 결과를 만들기 위해서는 일관된 부상이 필요합니다.형광 염료는 상처 마커로 효과적입니다. 형광 염료 확산 정도는 찔린 상처의 위치와 깊이를 나타냅니다. 이 기술은 잠재적으로 다른 작은 어종에 적용될 수 있으며, 메다카에 적응하면 재생 능력을 비교할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

메다카 계란을 사용하여 실버 Nanocolloids의 염도에 의존하는 독성 분석

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

분리 및 성인 개 해마 신경 전구체의 확장

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Spermatogenesis 마우스 모델을 사용 하 여의 Cytological 분석을 위한 Seminiferous 관 스쿼시 기술

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

성인 Zebrafish 부상 모델 뼈 조직 재생에 Prednisolone의 효과 연구

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

마이크로패턴과 정량적 이미징을 사용하여 포유류 세포의 응급 공간 조직 매핑

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...