Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI Grant Number 18K14824 och 21K15195 och ett internt bidrag från AIST, Japan.

Alla experimentella protokoll godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid National Institute of Advanced Industrial Science and Technology. Zebrafisk och medaka upprätthölls enligt standardprocedurer28.
1. Sticksårskada i vuxen optisk tektum
<ol><li>Förbered en 0,4% (w/v) trikainstamlösning för anestesi. För en 100 ml stamlösning, lös 400 mg trikainmetansulfonat (se materialtabell) i 90 ml destillerat vatten...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Här beskrivs en uppsättning metoder som kan användas för att inducera sticksårskador i optic tectum med hjälp av en nål för att underlätta utvärderingen av RGC-proliferation och differentiering efter hjärnskada. Nålmedierade sticksår är en enkel, effektivt implementerad metod som kan tillämpas på många experimentella prover med hjälp av en standarduppsättning verktyg. Sticksårskademodeller för flera regioner i zebrafiskhjärnan har utvecklats 3,19,29<sup class="xref...

Zebrafiskar (Danio rerio) har en ökad förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS) jämfört med andra däggdjur 1,2,3. För att bättre förstå de molekylära mekanismerna bakom denna ökade regenerativa kapacitet har jämförande analyser av vävnadsregenerering med nästa generations sekvenseringsteknik utförts 4,5,6. Hjärnstrukturerna hos zebrafiskar och tetrapoder är ganska olika 7,8,9. Detta innebär att flera hjärnskademodeller med små fiskar med liknande hjärnstrukturer och biologiska egenskaper har utvecklats för att underlätta undersökningen av de underliggande molekylära mekanismerna som bidrar till denna ökade regenerativa kapacitet.
Dessutom är medaka (Oryzias latipes) ett populärt laboratoriedjur med låg kapacitet för hjärt- och neuronal regenerering10,11,12,13 jämfört med zebrafisk. Zebrafisk och medaka har liknande hjärnstrukturer och nischer för vuxna neurala stamceller (NSC)14,15,16,17. I zebrafisk och medaka innehåller det optiska tektum två typer av NSC, neuroepitelliknande stamceller och radiella gliaceller (RGCs)15,18. En sticksårskada för optisk tektum hos vuxna zebrafiskar utvecklades tidigare, och denna modell användes för att undersöka de molekylära mekanismerna som reglerar hjärnregenerering hos dessa djur 19,20,21,22,23. Denna unga vuxna zebrafisk sticka sårskada modell inducerade regenerativ neurogenes från RGC 19,24,25. Denna sticksårskada i optisk tektum är en robust och reproducerbar metod 13,19,20,21,22,23,24,25. När samma skademodell tillämpades på vuxen medaka avslöjades den låga neurogena kapaciteten hos RGC i medaka optisk tektum via jämförande analys av RGC-proliferation och differentiering efter skada13.
Sticksårskademodeller i optisk tektum har också utvecklats i mummigrismodeller26, men detaljer om tektumskadan har inte dokumenterats väl jämfört med telencefalisk skada27. Sticksårskadan i optisk tektum med zebrafisk och medaka möjliggör undersökning av differentiella cellulära svar och genuttryck mellan arter med differentiell regenerativ kapacitet. Detta protokoll beskriver hur man utför en sticksårskada i optisk tektum med hjälp av en injektionsnål. Denna metod kan tillämpas på små fiskar som zebrafisk och medaka. Processerna för provberedning för histologisk analys och cellulär proliferation och differentieringsanalys med fluorescerande immunhistokemi och kryosektioner förklaras här.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Medan zebrafiskar har en överlägsen förmåga att regenerera sitt centrala nervsystem (CNS), har medaka en lägre CNS-regenerativ kapacitet. En hjärnskademodell utvecklades i det vuxna optiska tektum hos zebrafiskar och medaka och jämförande histologiska och molekylära analyser utfördes för att belysa de molekylära mekanismerna som reglerar den höga regenerativa kapaciteten hos denna vävnad över dessa fiskarter. Här presenteras en sticksårskademodell för det vuxna optiska tektum med hjälp av en nål och histologiska analyser för proliferation och differentiering av neurala stamceller (NSC). En nål sattes manuellt in i den centrala regionen av optisk tektum, och sedan perfuserades fisken intrakardiellt och deras hjärnor dissekerades. Dessa vävnader kryosektionerades sedan och utvärderades med hjälp av immunfärgning mot lämpliga NSC-proliferations- och differentieringsmarkörer. Denna tektumskademodell ger robusta och reproducerbara resultat i både zebrafisk och medaka, vilket gör det möjligt att jämföra NSC-svar efter skada. Denna metod är tillgänglig för små teleoster, inklusive zebrafisk, medaka och afrikansk killifisk, och gör det möjligt för oss att jämföra deras regenerativa kapacitet och undersöka unika molekylära mekanismer.

Sticksårskada i optisk tektum med nålinsättning i höger halvklot (figur 1, figur 4A och figur 5A) inducerar olika cellulära svar, inklusive radiell gliacellsproliferation (RGC) och generering av nyfödda neuroner. På liknande sätt användes åldrade populationer av zebrafisk och medaka för att motverka eventuella åldrande effekter i det regenerativa svaret. Därefter utfördes fluorescerande immunfärgning på de frysta sek...

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

En mekanisk hjärnskademodell hos vuxna zebrafiskar beskrivs för att undersöka de molekylära mekanismer som reglerar deras höga regenerativa kapacitet. Metoden förklarar att skapa en sticksårskada i optisk tektum hos flera arter av små fiskar för att utvärdera de regenerativa svaren med hjälp av fluorescerande immunfärgning.

Sticksårskademodell av Adult Optic Tectum med användning av zebrafisk och Medaka för jämförande analys av regenerativ kapacitet

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Sticksårskada är en mekanisk skademetod som inducerar ospecifik cellablation. Denna metod underlättar utvärderingen av RGC-proliferation och differentiering efter hjärnskada. Nålmedierad sticksårskada är en enkel, effektivt implementerad metod för att inducera hjärnskada.Denna metod kan tillämpas på många experimentella prover med hjälp av en standard uppsättning verktyg. Zebrafiskens regenerativa kapacitet illustrerades med hjälp av sticksårskademodellen. Nya insikter om molekylära mekanismer som reglerar neuronal regenerering bidrar till regenerativ terapi i centrala nervsystemet.Börja med att placera en sövd vuxen zebrafisk eller medaka på en frigolitbricka. Fäst fisken upprätt mellan två 30-gauge nålar som sätts in vertikalt i styrofoam. Håll fiskkroppen för att förhindra att fiskhuvudet rör sig och sätt sedan vertikalt in en 30-gauge nål genom skallen i den mediala regionen av en av de optiska tektumsfärerna.Överför sedan den skadade fisken till ett akvarium med färskt fiskanläggningsvatten. När fisken har återhämtat sig helt från anestesin, flytta tanken till avelssystemet. Lägg pappershanddukar på frigolitbrickan för att placera den bedövade fisken.Håll sedan fiskkroppen på plats genom att vertikalt sätta in två 30-gauge nålar på vardera sidan av analfenan. När fisken är placerad, gör ett ventralt snitt från anus till hjärtat. Håll hjärtat synligt genom att sätta in två 30-gauge nålar på varje sida.Använd sedan spetsen på pincetten för att ta bort silverepitelskiktet. Sätt in 30-gauge nålen i ventrikeln, håll avfasningen uppåt och gör ett snitt i atriumet med hjälp av pincetten. Tryck sedan PBS in i atriumet genom att trycka ner sprutan för att spola blodet från atriumet.När blodet dräneras och gälarna blir vita, stoppa PBS-perfusionen. Senare, ta bort nålarna som fixerar fiskkroppen på plats och fixa fiskens ventrala sida nedåt. Efter att ha klippt ryggmärgen och tagit bort skallen från optisk tektum och telencephalon, skära de optiska nerverna och dissekera hjärnan.Överför sedan hjärnorna till 1,5 milliliter rör med en milliliter 4% paraformaldehyd i PBS, för att fixa över natten vid fyra grader Celsius. Efter att ha tvättat de fasta hjärnorna tre gånger i PBS i fem minuter vardera, överför hjärnorna till 1,5 milliliter rör med en milliliter 30% viktvikt sackaros i PBS som kryoskyddsmedel och inkubera dem över natten vid fyra grader Celsius. Förbered inbäddningsföreningen genom att kombinera 30% sackaros med 30 ml optimal skärtemperatur, eller OCT, förening och förvara föreningen vid fyra grader Celsius.För att kyla kryomolen en gång, inkubera ett aluminiumblock över natten vid minus 80 grader Celsius och lägg det förkylda blocket i en styrofoamlåda med lock för att förhindra uppvärmning. För koronala sektioner, bädda in den dissekerade hjärnan i en kryomold genom att justera orienteringen med pincett under mikroskopet. Placera sedan kryomolen på det förkylda aluminiumblocket i styrofoamlådan och låt OCT-föreningen frysa och bli vit.När föreningen fryser, applicera en liten cirkel OCT-förening på en provskiva innan du monterar kryoblocket på provskivan. Genom att placera provskivan i kryostaten, frys OCT-föreningen. Placera sedan provskivan på provhuvudet i kryostaten.Efter att ha ställt in kryoblockets orientering, trimma OCT för att ta bort eventuella extra regioner. Skär 14 mikrometer tjocka seriella sektioner genom hela optiska tektum med en kryostat och förvara glasen vid minus 25 grader Celsius. Den radiella gliacellen, eller RGC, proliferationen i hjärnvävnaden hos zebrafisk utvärderades.De flesta RGC var prolifererande cellantigennegativa i den kontralaterala oskadade halvklotet. Två dagar efter skadan inducerades RGC-proliferation på den skadade sidan av medaka tectum. Efter hjärnskadan utvärderades cellinje och RGC-differentiering med bromodeoxyuridin, eller BrdU, märkning.Den representativa analysen visar nyfödda neuroner sju dagar efter skada hos skadade zebrafiskar och medaka. Ett av de kritiska stegen vid sticksårskador är manuell nålinsättning. En konsekvent skada är nödvändig för att skapa reproducerbara resultat.Fluorescerande färgämnen är effektiva som sårmarkörer. Omfattningen av fluorescerande färgdiffusion indikerar platsen och djupet för sticksårskadan. Denna teknik är potentiellt anpassad till andra små fiskarter, och anpassning till medaka möjliggör jämförelser av regenerativ kapacitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Njure Regeneration i vuxen Zebrafish av Gentamicin inducerad skada

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Salthalt beroende toxicitet Analys av Silver Nanocolloids Använda Medaka ägg

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

Isolering och utbyggnad av vuxen hund Hippocampus neurala prekursorer

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In vivo avbildning av Transgena genuttryck i Individuell Retinal stamceller i chimär Zebrafish embryon att studera Cell Nonautonomous Influenser

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

En seminifera tubuli Squash teknik för Cytologisk analys av spermatogenesen använder musmodell

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Adult zebrafiskar skada modeller för att studera effekterna av prednisolon i regenererande benvävnad

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiella cellmigration i den framkallande Chick fiberoptiska Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Kartlägga den framväxande rumsliga organiseringen av däggdjursceller med hjälp av Mikromönster och kvantitativ avbildning

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...