Name: stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity
Uploaded: 2022-02-10T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Bu çalışma, JSPS KAKENHI Hibe Numarası 18K14824 ve 21K15195 ve AIST, Japonya'nın dahili hibesi ile desteklenmiştir.

Tüm deneysel protokoller, Ulusal İleri Endüstriyel Bilim ve Teknoloji Enstitüsü'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Zebra balığı ve medaka standart prosedürlere göre muhafaza edildi28.
1. Yetişkin optik tektumda bıçak yarası yaralanması
<ol><li>Anestezi için% 0.4 (w / v) trikain stok çözeltisi hazırlayın. 100 mL'lik bir stok çözeltisi için, 400 mg trikain metansülfonatı ( <stron...

<ol>
	<li>Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+regrowth+after+spinal+cord+transection+in+adult+zebrafish.">Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (4), 577-595 (1997).</li><li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish.">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Developmental Biology. 6, 36 (2006).</li><li>M&#228;rz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Str&#228;hle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+response+following+stab+injury+in+the+adult+zebrafish+telencephalon.">Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon.</a> Developmental Dynamics. 240 (9), 2221-2231 (2011).</li><li>Kang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+tissue+repair+by+regeneration+enhancer+elements.">Modulation of tissue repair by regeneration enhancer elements.</a> Nature. 532 (7598), 201-206 (2016).</li><li>Sim&#245;es, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+directly+contribute+collagen+to+scar+formation+during+zebrafish+heart+regeneration+and+mouse+heart+repair.">Macrophages directly contribute collagen to scar formation during zebrafish heart regeneration and mouse heart repair.</a> Nature Communications. 11 (1), 600 (2020).</li><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration.">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370 (6519), (2020).</li><li>Alunni, A., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+view+of+regenerative+neurogenesis+in+vertebrates.">A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates.</a> Development. 143 (5), 741-753 (2016).</li><li>Diotel, N., L&#252;bke, L., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+and+distinct+features+of+adult+neurogenesis+and+regeneration+in+the+telencephalon+of+zebrafish+and+mammals.">Common and distinct features of adult neurogenesis and regeneration in the telencephalon of zebrafish and mammals.</a> Frontiers in Neuroscience. 14, 568930 (2020).</li><li>Labusch, M., Mancini, L., Morizet, D., Bally-Cuif, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+divergent+features+of+adult+neurogenesis+in+zebrafish.">Conserved and divergent features of adult neurogenesis in zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 525 (2020).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+reparative+phenotypes+between+zebrafish+and+medaka+after+cardiac+injury.">Differential reparative phenotypes between zebrafish and medaka after cardiac injury.</a> Developmental Dynamics. 243 (9), 1106-1115 (2014).</li><li>Lai, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+analyses+in+zebrafish+and+medaka+reveal+that+harnessing+the+immune+response+promotes+cardiac+regeneration.">Reciprocal analyses in zebrafish and medaka reveal that harnessing the immune response promotes cardiac regeneration.</a> eLife. 6, 25605 (2017).</li><li>Lust, K., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+the+regenerative+potential+of+M&#252;ller+glia+cells+in+a+regeneration-deficient+retina.">Activating the regenerative potential of M&#252;ller glia cells in a regeneration-deficient retina.</a> eLife. 7, 32319 (2018).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regenerative+capacity+of+the+optic+tectum+of+adult+medaka+and+zebrafish.">Differential regenerative capacity of the optic tectum of adult medaka and zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 686755 (2021).</li><li>Adolf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+acquired+features+of+adult+neurogenesis+in+the+zebrafish+telencephalon.">Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon.</a> Developmental Biology. 295 (1), 278-293 (2006).</li><li>Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells+and+neurogenesis+in+the+adult+zebrafish+brain:+origin,+proliferation+dynamics,+migration+and+cell+fate.">Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate.</a> Developmental Biology. 295 (1), 263-277 (2006).</li><li>Alunni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+neural+stem+cells+in+the+medaka+optic+tectum+proliferation+zones.">Evidence for neural stem cells in the medaka optic tectum proliferation zones.</a> Developmental Neurobiology. 70 (10), 693-713 (2010).</li><li>Kuroyanagi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation+zones+in+adult+medaka+(Oryzias+latipes)+brain.">Proliferation zones in adult medaka (Oryzias latipes) brain.</a> Brain Research. 1323, 33-40 (2010).</li><li>Ito, Y., Tanaka, H., Okamoto, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neural+stem+cells+and+their+progeny+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Characterization of neural stem cells and their progeny in the adult zebrafish optic tectum.</a> Developmental Biology. 342 (1), 26-38 (2010).</li><li>Shimizu, Y., Ueda, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+proliferation+and+differentiation+of+radial+glia+in+regenerative+processes+after+stab+injury+in+the+optic+tectum+of+adult+zebrafish.">Wnt signaling regulates proliferation and differentiation of radial glia in regenerative processes after stab injury in the optic tectum of adult zebrafish.</a> Glia. 66 (7), 1382-1394 (2018).</li><li>Ueda, Y., Shimizu, Y., Shimizu, N., Ishitani, T., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+sonic+hedgehog+and+notch+signaling+in+regenerative+neurogenesis+in+adult+zebrafish+optic+tectum+after+stab+injury.">Involvement of sonic hedgehog and notch signaling in regenerative neurogenesis in adult zebrafish optic tectum after stab injury.</a> Journal of Comparative Neurology. 526 (15), 2360-2372 (2018).</li><li>Kiyooka, M., Shimizu, Y., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+deacetylase+inhibition+promotes+regenerative+neurogenesis+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Histone deacetylase inhibition promotes regenerative neurogenesis after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 529 (2), 366-371 (2020).</li><li>Shimizu, Y., Kawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+acetyltransferase+EP300+regulates+the+proliferation+and+differentiation+of+neural+stem+cells+during+adult+neurogenesis+and+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+optic+tectum.">Histone acetyltransferase EP300 regulates the proliferation and differentiation of neural stem cells during adult neurogenesis and regenerative neurogenesis in the zebrafish optic tectum.</a> Neuroscience Letters. 756, 135978 (2021).</li><li>Shimizu, Y., Kiyooka, M., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+reveal+IL6/Stat3+signaling+involvement+in+radial+glia+proliferation+after+stab+wound+injury+in+the+adult+zebrafish+optic+tectum.">Transcriptome analyses reveal IL6/Stat3 signaling involvement in radial glia proliferation after stab wound injury in the adult zebrafish optic tectum.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 668408 (2021).</li><li>Lindsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain+tectal+stem+cells+display+diverse+regenerative+capacities+in+zebrafish.">Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4420 (2019).</li><li>Yu, S., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+cell-cycle+entry+and+cell-state-dependent+fate+outputs+of+injury-reactivated+tectal+radial+glia+in+zebrafish.">Stochastic cell-cycle entry and cell-state-dependent fate outputs of injury-reactivated tectal radial glia in zebrafish.</a> eLife. 8, 48660 (2019).</li><li>Bisese, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+acute+transcriptome+response+of+the+midbrain/diencephalon+to+injury+in+the+adult+mummichog+(Fundulus+heteroclitus).">The acute transcriptome response of the midbrain/diencephalon to injury in the adult mummichog (Fundulus heteroclitus).</a> Molecular Brain. 12 (1), 119 (2019).</li><li>Schmidt, R., Beil, T., Str&#228;hle, U., Rastegar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stab+wound+injury+of+the+zebrafish+adult+telencephalon:+a+method+to+investigate+vertebrate+brain+neurogenesis+and+regeneration.">Stab wound injury of the zebrafish adult telencephalon: a method to investigate vertebrate brain neurogenesis and regeneration.</a> Journal of Visualized Experiments. (4), e51753 (2014).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio) 5th ed. , (2007).</li><li>Kaslin, J., Kroehne, V., Ganz, J., Hans, S., Brand, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+of+neuroepithelial-like+and+radial+glia-like+progenitor+cells+in+cerebellar+regeneration.">Distinct roles of neuroepithelial-like and radial glia-like progenitor cells in cerebellar regeneration.</a> Development. 144 (8), 1462-1471 (2017).</li><li>Curado, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+targeted+cell+ablation+in+zebrafish:+a+new+tool+for+regeneration+studies.">Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies.</a> Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).</li><li>Shimizu, Y., Ito, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glial+cell-specific+ablation+in+the+adult+zebrafish+brain.">Radial glial cell-specific ablation in the adult zebrafish brain.</a> Genesis. 53 (7), 431-439 (2015).</li><li>Godoy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+neurons+regenerate+following+chemogenetic+ablation+in+the+olfactory+bulb+of+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Dopaminergic neurons regenerate following chemogenetic ablation in the olfactory bulb of adult zebrafish (Danio rerio).</a> Scientific Reports. 10 (1), 12825 (2020).</li><li>Sawahata, M., Izumi, Y., Akaike, A., Kume, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+brain+ischemia-reperfusion+model+induced+by+hypoxia-reoxygenation+using+zebrafish+larvae.">In vivo brain ischemia-reperfusion model induced by hypoxia-reoxygenation using zebrafish larvae.</a> Brain Research Bulletin. 173, 45-52 (2021).</li></ol>

Burada, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonunun ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırmak için bir iğne kullanarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmalarını indüklemek için kullanılabilecek bir dizi yöntem açıklanmaktadır. İğne aracılı bıçak yaraları, standart bir alet seti kullanılarak birçok deneysel örneğe uygulanabilen basit, verimli bir şekilde uygulanan bir yöntemdir. Zebra balığı beyninin çeşitli bölgeleri için bıçak yarası yaralanma modelleri gelişt...

Zebra balığı (Danio rerio), diğer memelilere kıyasla merkezi sinir sistemini (CNS) yenileme yeteneğinde artışa sahiptir 1,2,3. Son zamanlarda, bu artan rejeneratif kapasitenin altında yatan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamak için, yeni nesil dizileme teknolojisi kullanılarak doku rejenerasyonunun karşılaştırmalı analizleri yapılmıştır 4,5,6. Zebra balığı ve tetrapodlardaki beyin yapıları oldukça farklıdır 7,8,9. Bu, benzer beyin yapılarına ve biyolojik özelliklere sahip küçük balıkların kullanıldığı birkaç beyin hasarı modelinin, bu artan rejeneratif kapasiteye katkıda bulunan altta yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasını kolaylaştırmak için geliştirildiği anlamına gelir.
Ek olarak, medaka (Oryzias latipes), zebra balığı ile karşılaştırıldığında 10,11,12,13 kalp ve nöronal rejenerasyon için düşük kapasiteye sahip popüler bir laboratuvar hayvanıdır. Zebra balığı ve medaka, yetişkin nöral kök hücreler (NSC'ler) için benzer beyin yapılarına ve nişlere sahiptir14,15,16,17. Zebra balığı ve medaka'da, optik tektum iki tip NSC, nöroepitel benzeri kök hücreler ve radyal glial hücreler (RGC'ler) içerir15,18. Yetişkin zebra balıklarının optik tektumunda bıçak yarası yaralanması daha önce geliştirilmiş ve bu model bu hayvanlarda beyin rejenerasyonunu düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için kullanılmıştır 19,20,21,22,23. Bu genç yetişkin zebra balığı bıçak yarası yaralanma modeli, RGC'lerden 19,24,25 rejeneratif nörogeneze neden olmuştur. Optik tektumdaki bu bıçak yarası yaralanması sağlam ve tekrarlanabilir bir yöntemdir 13,19,20,21,22,23,24,25. Aynı yaralanma modeli erişkin medakaya uygulandığında, medaka optik tektumdaki RGC'lerin düşük nörojenik kapasitesi, yaralanma sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşmasının karşılaştırmalı analizi ile ortaya konmuştur13.
Optik tektumdaki bıçak yarası yaralanma modelleri mummichog modelleri26'da da geliştirilmiştir, ancak tektum yaralanmasının ayrıntıları telensefalik yaralanma27 ile karşılaştırıldığında iyi belgelenmemiştir. Zebra balığı ve medaka kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması, diferansiyel rejeneratif kapasiteye sahip türler arasındaki diferansiyel hücresel tepkilerin ve gen ekspresyonunun araştırılmasına olanak sağlar. Bu protokol, bir enjeksiyon iğnesi kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanmasının nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Bu yöntem zebra balığı ve medaka gibi küçük balıklara uygulanabilir. Burada histolojik analiz için numune hazırlama ve floresan immünohistokimya ve kriyoseksiyonlar kullanılarak hücresel proliferasyon ve farklılaşma analizi süreçleri açıklanmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SS-10ESZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 9.0)</td>
			<td>NIPPON GENE</td>
			<td>314-90381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>Dentronics</td>
			<td>HS-2739A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Wako</td>
			<td>163-20145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>115 x 80 x 37 mm (W x D x H) is enough size to freeze 6 cryomolds</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BLBP</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ABN14</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BrdU</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab1893</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HuC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21271</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PCNA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-56</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brmodeoxyuridine</td>
			<td>Wako</td>
			<td>023-15563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope C1 plus</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryomold</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>4565</td>
			<td>10 x 10 x 5 mm (W x D x H)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Danio rerio WT strains RW</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension tube</td>
			<td>TERUMO</td>
			<td>SF-ET3520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount (TM) Aqueous Mounting Medium, for use with fluorescent dye-stained tissues</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F4680-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>DUMONT</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A32723</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342 solution</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>23491-52-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Wako</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Chamber for 10 slides Dark Orange</td>
			<td>COSMO BIO CO., LTD.</td>
			<td>10DO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAS coat sliding glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>MAS-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover glass</td>
			<td>Matsunami glass</td>
			<td>C024451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal horse serum blocking solution</td>
			<td>VECTOR LABRATORIES</td>
			<td>S-2000-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek Japan</td>
			<td>83-1824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oryzias latipes WT strains Cab</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen Super-Liquid Blocker</td>
			<td>DAIDO SANGYO</td>
			<td>PAP-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, pH 7.4</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T9181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Styrofoam tray</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>100 x 100 x 10 mm (W x D x H) styrofoam sheet is available as tray</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Wako</td>
			<td>196-00015</td>
			<td>30 % (w/v) Sucrose in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS-222)</td>
			<td>nacarai tesque</td>
			<td>14805-24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate Dihydrate</td>
			<td>Wako</td>
			<td>191-01785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Wako</td>
			<td>04605-250</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stab wound injury model of the adult optic tectum using zebrafish and medaka for the comparative analysis of regenerative capacity

Zebra balığı, merkezi sinir sistemini (CNS) yenilemek için üstün bir kapasiteye sahipken, medaka daha düşük bir CNS rejeneratif kapasitesine sahiptir. Zebra balığı ve medaka'nın yetişkin optik tektumunda bir beyin hasarı modeli geliştirilmiş ve bu balık türleri arasında bu dokunun yüksek rejeneratif kapasitesini düzenleyen moleküler mekanizmaları aydınlatmak için karşılaştırmalı histolojik ve moleküler analizler yapılmıştır. Burada erişkin optik tektum için nöral kök hücrelerin (NSC) proliferasyonu ve farklılaşması için bir iğne ve histolojik analizler kullanılarak bir bıçak yarası yaralanma modeli sunulmuştur. Optik tektumun merkezi bölgesine manuel olarak bir iğne sokuldu ve daha sonra balıklar intrakardiyal olarak perfüze edildi ve beyinleri diseke edildi. Bu dokular daha sonra kriyoseksiyona tabi tutuldu ve uygun NSC proliferasyonu ve farklılaşma belirteçlerine karşı immün boyama kullanılarak değerlendirildi. Bu tektum yaralanma modeli, hem zebra balığı hem de medaka'da sağlam ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve yaralanma sonrası NSC yanıtlarını karşılaştırmaya olanak tanır. Bu yöntem, zebra balığı, medaka ve Afrika killifish dahil olmak üzere küçük teleostlar için mevcuttur ve rejeneratif kapasitelerini karşılaştırmamızı ve benzersiz moleküler mekanizmaları araştırmamızı sağlar.

Sağ yarımküreye iğne sokulması kullanılarak optik tektumda bıçak yarası yaralanması (Şekil 1, Şekil 4A ve Şekil 5A), radyal glial hücre (RGC) proliferasyonu ve yenidoğan nöronlarının oluşumu dahil olmak üzere çeşitli hücresel yanıtları indükler. Benzer şekilde, zebra balığı ve medaka'nın yaşlı popülasyonları, rejeneratif yanıttaki yaşlanma etkilerine karşı koymak için kullanılmıştır. Daha ...

Watch this Scientific Journal Video about Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity at JoVE.com

Stab Wound Injury Model of the Adult Optic Tectum Using Zebrafish and Medaka for the Comparative Analysis of Regenerative Capacity

Yetişkin zebra balıklarında mekanik bir beyin hasarı modeli, yüksek rejeneratif kapasitelerini düzenleyen moleküler mekanizmaları araştırmak için tanımlanmıştır. Yöntem, floresan immünoboyama kullanarak rejeneratif yanıtları değerlendirmek için birden fazla küçük balık türünün optik tektumunda bir bıçak yarası yaralanması oluşturmayı açıklar.

Rejeneratif Kapasitenin Karşılaştırmalı Analizi için Zebra Balığı ve Medaka Kullanan Yetişkin Optik Tektumunun Bıçak Yarası Yaralanma Modeli

While zebrafish have a superior capacity to regenerate their central nervous system (CNS), medaka has a lower CNS regenerative capacity. A brain injury ...

Bıçak yarası yaralanması, nonspesifik hücre ablasyonunu indükleyen mekanik bir yaralanma yöntemidir. Bu yöntem, beyin hasarı sonrası RGC proliferasyonu ve farklılaşmasının değerlendirilmesini kolaylaştırır. İğne aracılı bıçak yarası yaralanması, beyin hasarını indüklemek için basit, etkili bir şekilde uygulanan bir yöntemdir.Bu yöntem, standart bir araç seti kullanılarak birçok deneysel numuneye uygulanabilir. Zebra balıklarının rejeneratif kapasitesi, bıçak yarası yaralanma modeli kullanılarak gösterilmiştir. Nöronal rejenerasyonu düzenleyen moleküler mekanizmaya yeni bakış açıları, merkezi sinir sisteminde rejeneratif tedaviye katkıda bulunur.Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebra balığı veya medaka'yı strafor tepsiye yerleştirerek başlayın. Balıkları, straforun içine dikey olarak yerleştirilmiş iki adet 30 gauge iğne arasına dik olarak sabitleyin. Balık kafasının hareket etmesini önlemek için balık gövdesini tutun ve ardından kafatasından optik tektum kürelerinden birinin medial bölgesine dikey olarak 30 gauge'lik bir iğne yerleştirin.Daha sonra, yaralı balıkları taze balık tesisi suyu olan bir balık tankına aktarın. Balıklar anesteziden tamamen iyileştikten sonra, tankı üreme sistemine taşıyın. Anestezi uygulanan balıkları yerleştirmek için strafor tepsiye kağıt havlu koyun.Ardından, anal yüzgecin her iki tarafına dikey olarak iki adet 30 gauge iğne yerleştirerek balık gövdesini yerinde tutun. Balık yerleştirildikten sonra, anüsten kalbe ventral bir kesi yapın. Her iki tarafa iki adet 30 gauge iğne yerleştirerek kalbi görünür tutun.Daha sonra gümüş epitel tabakasını çıkarmak için forsepsin ucunu kullanın. 30 gauge iğneyi ventriküle yerleştirin, eğimi yukarıda tutun ve forsepsleri kullanarak atriyuma bir kesi yapın. Daha sonra, kanı atriyumdan temizlemek için şırıngaya bastırarak PBS'yi atriyuma itin.Kan boşaltıldığında ve solungaçlar beyaza döndüğünde, PBS perfüzyonunu durdurun. Daha sonra, balık gövdesini yerine sabitleyen iğneleri çıkarın ve balık ventral tarafını aşağı doğru sabitleyin. Omuriliği kestikten ve kafatasını optik tektumdan ve telensefalondan çıkardıktan sonra, optik sinirleri kesin ve beyni diseke edin.Daha sonra, beyinleri PBS'de bir mililitre% 4 paraformaldehit içeren 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Sabit beyinleri PBS'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkadıktan sonra, beyinleri PBS'de kriyoprotektan olarak hacimce% 30 ağırlığında bir mililitre ile 1.5 mililitrelik tüplere aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. % 30 sakkarozu 30 mililitre optimum kesme sıcaklığı veya OCT, bileşiği ile birleştirerek gömme bileşiğini hazırlayın ve bileşiği dört santigrat derecede saktora saklayın.Kriyomoldu bir kez soğutmak için, bir alüminyum bloğu gece boyunca eksi 80 santigrat derecede inkübe edin ve önceden soğutulmuş bloğu ısınmayı önlemek için kapaklı bir strafor kutuya koyun. Koronal kesitler için, mikroskop altında forseps kullanarak oryantasyonu ayarlayarak disseke edilmiş beyni bir kriyomolda gömün. Daha sonra, kriyomoldu strafor kutudaki önceden soğutulmuş alüminyum blok üzerine yerleştirin ve OCT bileşiğinin donmasına ve beyazlaşmasına izin verin.Bileşik donduğunda, kriyobloğu numune diskine monte etmeden önce bir numune diskine küçük bir OCT bileşiği çemberi uygulayın. Numune diskini kriyostata yerleştirerek, OCT bileşiğini dondurun. Daha sonra numune diskini kriyostattaki numune kafasına yerleştirin.Kriyoblokun yönünü ayarladıktan sonra, ekstra bölgeleri çıkarmak için OCT'yi kırpın. Bir kriyostat kullanarak tüm optik tektum boyunca 14 mikrometre kalınlığında seri kesitleri kesin ve slaytları eksi 25 santigrat derecede saklayın. Zebra balıklarının beyin dokusundaki radyal glial hücre veya RGC proliferasyonu değerlendirildi.RGC'lerin çoğu, kontralateral yaralanmamış yarımkürede proliferasyon yapan hücre antijeni negatifti. Yaralanmadan iki gün sonra, medaka tektumunun yaralı tarafında RGC proliferasyonu indüklendi. Beyin hasarından sonra, hücre soyu ve RGC farklılaşması bromodeoksiüridin veya BrdU etiketlemesi ile değerlendirildi.Temsili analiz, yaralı zebra balığı ve medaka'da yaralanmadan yedi gün sonra yenidoğan nöronlarını göstermektedir. Bıçak yarası yaralanmalarında kritik adımlardan biri manuel iğne yerleştirmedir. Tekrarlanabilir sonuçlar yaratmak için tutarlı bir yaralanma gereklidir.Floresan boyalar yara belirteçleri olarak etkilidir. Floresan boya difüzyonunun derecesi, bıçak yarası yaralanmasının yerini ve derinliğini gösterir. Bu teknik potansiyel olarak diğer küçük balık türlerine uyarlanmıştır ve medaka'ya adaptasyon, rejeneratif kapasitenin karşılaştırılmasına izin verir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

Gelişim Biyolojisi

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Salinity-dependent Toxicity Assay of Silver Nanocolloids Using Medaka Eggs

Medaka Yumurta kullanma Gümüş Nanocolloids tuzluluk bağımlı zehirlilik Deneyi

Salinity is an important characteristic of the aquatic environment. For aquatic organisms it defines the habitats of freshwater, brackish water, and ...

Isolation and Expansion of Adult Canine Hippocampal Neural Precursors

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

The rate of neurogenesis within the adult hippocampus has been shown to vary across mammalian species. The canine hippocampus, demonstrating a structural ...

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

A Seminiferous Tubule Squash Technique for the Cytological Analysis of Spermatogenesis Using the Mouse Model

Seminifer tübül Squash tekniği fare modeli kullanarak sperma saytolojik analizi için

Meiotic progression in males is a process that requires the concerted action of a number of highly regulated cellular events. Errors occurring during ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Kemik doku Yenileyici prednizolon etkilerini incelemek için yetişkin zebra balığı yaralanma modelleri

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Görselleştirme teğet hücre göç gelişmekte olan piliç optik Tectum içinde

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

Meme hücrelerinin Mikrodesenler ve nicel görüntüleme kullanarak acil uzamsal organizasyonu haritalama

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...