Visualisering av biologiske makromolekyler er en kritisk ferdighet for studenter og fagfolk i biovitenskapene. I denne protokollen demonstrerer vi hvordan du modellerer det aktive stedet for enzymet glukokinase ved hjelp av fire fritt tilgjengelige programmer for molekylær modellering. Denne opplæringen fremhever flere trinn i protokollen for hvert program, som inkluderer å velge bundne ligander og bruke ligandene til å vise aminosyrer og vannmolekyler innen fem angstrom.

Støtteinformasjonen for dette manuskriptet inneholder en dedikert video for hvert program, som beskriver alle trinnene i protokollen med ytterligere forklaring. Strukturen vil modellere PDBID. 3FGU representerer det katalytiske komplekset av enzymet glukokinase.

Enzymet aktivt sted er bundet til to av sine substrater, beta-D-glukose, som har gitt identifikatoren BGC og en magnesiumion, MG. I tillegg er dette substratanalogen, en fosfo aminofosforsyre, adenylat ester, ANP bundet til glukokinase aktivt sted. Denne ikke-hydrolysable analogen av adenosin tripfosfat, ATP forhindrer at fosforyleringsreaksjonen oppstår, noe som fanger det aktive stedet kompleks prekatalyse. Grensesnittet til UCSF ChimeraX-modelleringsprogrammet inneholder rullegardinmenyer, en verktøylinje, strukturviseren og en kommandolinje.

Vi starter protokollen med trinn 1.4, og velger rester innen fem angstrom for å definere et aktivt område. For å velge ligandene trykker du på kontrollskiftet og klikker på et atom eller en binding i hver av de tre ligandene. Trykk pil opp til alle de tre ligandene er uthevet med en grønn glød.

Definer valget for fremtidig bruk ved å klikke på rullegardinmenyen, velge definere velger, skrive inn ligander for utvalgsnavnet og klikke ok. Velg sone på den valgte menyen. Aktiver/deaktiver dette for å rester, og kontroller at det er merket av i den øverste boksen.

Klikk ok. Legg merke til at delene av tegneserien innen fem angstrom av disse ligandene er uthevet. For å vise sidekjedene som pinner og vise det aktive stedet, bruker vannmolekylene handlingsmenyen atombindinger for å vise dem.

Eller slå dem på med disse knappene her. Hvis du vil fjerne merkingen, klikker du hvor som helst i det tomme området. Det endelige resultatet av denne protokollen bør være en modell med proteinets aktive sted og ligandene vist som pinner farget på en kontrasterende måte.

Viktige polarbindingssamhandlinger vises med stiplede linjer, og noen av rester som gjør kontakter er merket. ICn3D-grensesnittet inneholder rullegardinmenyer, strukturvisningsprogrammet og en kommandologg. Denne visningen viser hurtigmenyene velg sett og sekvens og merknader, som vises når brukeren utfører kommandoer som krever dem.

Vi starter protokollen i trinn 2.4, og velger rester innen fem angstrom for å definere et aktivt område. Hvis du vil velge ligandene, bruker du rullegardinmenyen select og klikker på velg på 3D, og kontrollerer at det er merket av for rester. Hold nede alt-knappen på en PC eller alternativknappen på en Mac, klikk på den første liganden.

Trykk deretter på kontrollen og klikk på de resterende to liganene for å legge dem til i det merkede området. Lagre det merkede området ved hjelp av rullegardinmenyen, klikk på velg, lagre merket område, skriv inn et navn og klikk lagre. Hurtigmenyen for valgsett vises nå med de tre ligandene valgt.

Velg nå rester innen fem angstrom av ligands. Bruk rullegardinmenyen velg etter avstand. Endre det andre elementspydet med en radius til fem angstrom i hurtigmenyen som vises, ved å skrive inn blokken.

Lukk deretter vinduet ved å klikke på X øverst til høyre. Lagre de fem angstene fra det aktive nettstedet ved å klikke på rullegardinmenyen, velg Lagre valg og bruk tastaturet til å skrive inn et navn. Klikk deretter lagre.

Nå oppretter du et nytt valg som kombinerer de to settene. Disse kan kombineres i hurtigmenyen for utvalgte sett. På en PC klikker du på de to settene eller klikker på en Mac-kommando.

Klikk igjen rullegardinmenyen, velg Lagre merket område og skriv inn et nytt navn, og klikk deretter Lagre. Hvis du vil vise interaksjoner som hydrogenbindinger, bruker du analysemenyen og velger samhandlinger. Vi vil bare være interessert i hydrogenbindinger og saltbroer her.

Så vi fjerner merket for resten av disse. Vi velger tre ligander. Og for det andre settet, rester innen fem angstroms.

Klikk på 3D-visningssamhandlinger og lukk vinduet. Dette viser noen av rester som samhandler, men det viser ikke hele fem angst fra aktivt nettsted. For å vise som vil bruke menyen for valgsett på nytt.

Klikk på fem angstrom fulle og deretter i rullegardinmenyen, klikk på stil sidekjeder, pinner. For å bruke CPK-fargestoffer, klikk på rullegardinmenyen for farge og klikk på atom. Det endelige resultatet av protokollen bør være en modell som ser slik ut med proteinets aktive sted og liganden vist som pinner farget på en kontrasterende måte.

Viktige bindingssamhandlinger vises med prikkede linjer, og alle rester i ett av valgene som ble opprettet under protokollen, merkes. Jmol-grensesnittet inneholder rullegardinmenyer, en verktøylinje, strukturviseren, en popup-meny og Jmol-konsollen som inneholder kommandolinjen. Vi starter Jmol-protokollen i trinn 3.4, og velger rester innen fem angstrom for å definere et aktivt sted.

Jmol-konsollen er den beste måten å velge rester innen fem angstrom. Skriv inn denne kommandoen for å velge rester innen fem angstrom for de tre ligandene. 193 atomer er valgt, men disse representerer ikke de fulle aminosyrerester.

Hvis du vil merke disse, bruker du kommandoen type, velger innenfor(gruppe, valgt) og trykker ENTER. Legg merke til at flere markeringsglorier vises. For å vise disse rester som pinner, høyreklikk for å få opp popup-menyen, hold pekeren over stil, skjema og klikk deretter pinner.

Legg merke til at det fortsatt er noen tomme glorier her. Dette er vannmolekylene på det aktive stedet. For å velge bare vannmolekylene, kan vi utføre denne kommandoen på nytt og deretter endre den.

Klikk i konsollen, bruk deretter pil opp for å finne kommandoen, og klikk Enter for å kjøre den på nytt. For å vise vannmolekylene som atomer, ønsker vi å fjerne valget av ligand og protein. Vi skriver inn to kommandoer for å gjøre det.

Våre liganer regnes som heterogrupper, men vann regnes også som en. Så innenfor denne kommandoen må vi definere at vi ikke fjerner vannet. Trykk enter, og nå er bare vannmolekylene valgt.

Klikk på rullegardinmenyen, hold markøren over atom og klikk på 20% av van der Waals radius. Den grønne magnesiumionen vises fortsatt som pinner. Oftere vises ioner som sfærer.

Klikk i Jmol-konsollen og skriv deretter inn select MG og fyll deretter 50%Ligandene i kjedene er farget identisk. Hvis du vil skille dem fra hverandre, er det nyttig å endre fargene i ligandene. I konsollen skal jeg utføre en flerlinjet kommando, som jeg har kopiert innlimt fra et jukseark som jeg utdyper i Jmol-tilleggsvideoen.

Resultatet av denne protokollen bør være en modell som ser slik ut med det aktive stedet for proteinet vist som pinner. Og ligandene viste oss pinner i et mykere fargevalg. Gule linjer indikerer bindingssamhandlinger og individuelle rester er merket etter ønske.

PyMOL-grensesnittet inneholder rullegardinmenyer, strukturviseren, navneobjektpanelet og musekontrollmenyen. Hovedkommandolinjen er også merket i denne figuren. Vi starter primalprotokollen i trinn 4.4, og velger rester innen fem angstrom for å definere et aktivt sted.

For å velge ligandene, klikk på hver av dem. Et nytt utvalg dukker opp, som kan gis nytt navn ved å klikke på A-knappen. Bruk tastaturet til å slette bokstavene sele og skrive liganer i stedet for dem.

Trykk ENTER. Vi kan bruke dette utvalget til å definere området rundt det. Begynn med å klikke A-knappen og velg menyelementet duplisert.

I dette nye merkede området, sel01, klikker du A og velger menyelementet Gi nytt navn. Bruk tastaturet til å slette eksisterende bokstaver og skrive aktiv. Dette er fortsatt å velge våre tre ligander, så vi må endre det igjen, ved hjelp av A-handlinger-knappen.

Klikk knappen, velg endre og utvid utvalget med fem angstrom. Nå har vi fanget ligandene og restene innen fem angstrom. S på S-knappen står for show.

Klikk på dette for å vise proteinet på forskjellige måter. Vi viser lakrisen som pinner. Klikk i det tomme området for å fjerne merkingen.

Dette har fanget aminosyrene innen fem angstrom, men ikke vannet. Vi kan igjen, duplisere utvalget og nå endre det for å velge bare vannet. Duplisere i handlinger A-knappen.

Merket område 2 vises. La oss endre navnet på dette til aktivt vann. Denne gangen bruker vi A-knappen til å endre, rundt for å velge atomene rundt utvalget vårt.

Atomer innen fire angstrom. Dette har valgt vannet, men også noen atomer av sidekjedene. For å endre dette ytterligere, bruk A-knappen til å modifisere og begrense til løsningsmiddel.

Nå kan vi se at bare vannmolekylene lyser opp. Igjen i A-knappen kan vi bruke en forhåndsinnstilling. Velg forhåndsinnstilt, ball og pinne, og nå vises vannmolekylene som sfærer.

Det endelige resultatet av protokollen er en modell som ser slik ut med det aktive stedet i ligander vist som pinner farget på en kontrasterende måte. Gule streklinjer viser polarbindingssamhandlinger, og individuelle rester merkes ved hjelp av markeringene som er opprettet i objektpanelet for navn. Feil i utførelsen av protokollen kan føre til suboptimale resultater.

For eksempel vises hele proteinet som pinner. For å feilsøke må brukeren først skjule pinnerepresentasjonen for hele strukturen. Og vis deretter pinnerepresentasjonen på nytt bare for objektet som kalles aktivt, ved hjelp av S-knappen.

Her vises modellene som genereres ved hjelp av hvert program side om side. Selv om det er forskjeller i visningen av enzymet, kan de samme nøkkelfunksjonene og interaksjonene ses i hver av de fire modellene. En bruker som er interessert i å mestre et av programmene som inneholder en kommandolinje, vil lære å bruke og endre innskrevne kommandoer.

Som jeg henviste til i Jmol-protokollen, er et nyttig verktøy et kommandojuksark. En ren tekstfil som inneholder ofte brukte koder som skal refereres til. For å bli en avansert bruker er det nyttig å forstå hvilke deler av protokollen som kan tilpasses og endres.

Med praksis kan disse protokollene brukes til å modellere ethvert enzymaktivt interessested.

Summary

Explore More Videos

Biokjemi

utgave 178