Name: determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants at JoVE.com

We bedanken voormalige en huidige medewerkers van pelegri lab animal husbandry voor hun zorg voor de waterfaciliteit. We zijn ook dankbaar voor de commentaren en inzichten op het manuscript van Ryan Trevena en Diane Hanson. Financiering werd verstrekt door NIH-subsidie aan F.P. (GM065303)

In studies die hebben geleid tot de ontwikkeling van dit protocol, werden alle zebravishuisvesting en experimenten goedgekeurd door de University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2).
1. Synthese van guide-RNA's
OPMERKING: Zygotische crispants zijn gemaakt met behulp van een enkel gids-RNA of multiplexing van meerdere gids-RNA's naar een enkel doel 5,6,7,8,9,10.<sup clas...

<ol>
	<li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+factors+in+zebrafish+development.">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li><li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis.">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), 2996-3008 (2015).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li><li>He, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-specific+maternal+Slbp2+is+required+for+replication-dependent+histone+storage+and+early+nuclear+cleavage+in+zebrafish+oogenesis+and+embryogenesis.">Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis.</a> RNA. 24 (12), 1738-1748 (2018).</li><li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).</li><li>Jao, L. -. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish.">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li><li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens.">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li><li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+CRISPR/Cas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function.">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).</li><li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish.">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li><li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants.">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), 199536 (2021).</li><li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells:+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA.">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li><li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+segregation,+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo.">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li><li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3'UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish.">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li><li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells.">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li><li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs.">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP:+a+CRISPR/Cas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing.">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li><li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish.">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 377-392 (2019).</li><li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish.">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860 (2017).</li><li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition.">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ensembl+gene+annotation+system.">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+identification+of+CRISPR/Cas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio.">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).</li><li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs,+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish.">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).</li><li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+into+zebrafish+embryos.">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li><li>Biology Mouse, ., Zebrafish, , Chick, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology:+Mouse,+Zebrafish,+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques.">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR/Cas9+zebrafish+mutant+screening.">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos.">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization.">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), 2955-2967 (2005).</li><li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., G&#246;mann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish.">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li></ol>

Het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, maakt de identificatie en primaire moleculaire karakterisering van een fenotype met moedereffect in een enkele generatie mogelijk in plaats van de meerdere generaties die nodig zijn voor zowel voorwaartse als omgekeerde genetische technieken. Momenteel is de rol van veel moederlijk tot expressie gebrachte genen onbekend. Dit gebrek aan kennis is deels te wijten aan de extra generatie die nodig is om een fenotype te visualiseren bij het identificeren van maternale-ef...

Een pool van maternale afgezette producten (bijv. RNA's, eiwitten en andere biomoleculen) is noodzakelijk voor alle vroege cellulaire processen totdat het zygote genoom van het embryo wordt geactiveerd1. De voortijdige uitputting van deze producten uit de eicel is typisch embryonaal dodelijk. Ondanks het belang van deze genen in de ontwikkeling, is de rol van veel moederlijk tot expressie gebrachte genen momenteel onbekend. Vooruitgang in genbewerkingstechnologie in zebravissen, zoals CRISPR-Cas9, maakt het mogelijk om moederlijk tot expressie gebrachte genente richten 2,3,4. De identificatie van een fenotype met maternale effecten vereist echter een extra generatie in vergelijking met een zygotisch fenotype, waardoor meer middelen nodig zijn. Onlangs is de biallelische bewerkingsmogelijkheid van CRISPR-Cas9 gebruikt om te screenen op embryonale fenotypen in somatische weefsels van geïnjecteerde (F0) embryo's, bekend als "crispants"5,6,7,8,9,10. De crispant-techniek maakt resource-efficiënte screening van kandidaatgenen in somatische cellen mogelijk, waardoor het begrip van specifieke aspecten in ontwikkeling wordt vergemakkelijkt. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, maakt de identificatie mogelijk van fenotypen met maternale effecten, of "maternale crispants", in een enkele generatie11. Dit schema is haalbaar door RNA's te multiplexen naar een enkel gen en biallelische bewerkingsgebeurtenissen in de kiembaan te bevorderen. Deze maternale crispante embryo's kunnen worden geïdentificeerd door grove morfologische fenotypen en ondergaan primaire karakterisering, zoals etikettering voor celgrenzen en DNA-patronen11. Gecombineerde analyse van het waarneembare fenotype en elementaire moleculaire karakterisering van de geïnduceerde INDELs maakt het mogelijk om de rol van het beoogde gen in de vroege ontwikkeling te voorspellen.
Bij zebravissen ontwikkelt zich tijdens de eerste 24 uur na de bevruchting (hpf) een kleine groep cellen tot de primordiale geslachtscellen, een voorloper van de kiembaan 12,13,14,15. In klauwen gelegd door F0-vrouwtjes hangt het aandeel van de maternale crispant-embryo's die worden hersteld af van het aantal geslachtscellen dat een biallelische bewerkingsgebeurtenis in het beoogde gen bevat. Over het algemeen geldt dat hoe eerder de bewerkingsgebeurtenis in het embryo plaatsvindt, hoe groter de kans dat CRISPR-Cas9-mutaties in de kiembaan worden waargenomen. In de meeste gevallen zijn de fenotypen van maternale crispante embryo's afkomstig van het verlies van functie in de twee maternale allelen die aanwezig zijn in de zich ontwikkelende eicel. Naarmate de eicel meiose voltooit, wordt een van de maternale allelen via het polaire lichaam uit het embryo geëxtrudeerd, terwijl het andere allel wordt opgenomen in de maternale pronucleus. De sequencing van meerdere maternale crispante haploïden vertegenwoordigt een mengsel van de mutaties (inserties en/of deleties (INDELs)) die aanwezig zijn in de kiembaan en die bijdragen aan fenotype11.
Het volgende protocol beschrijft de noodzakelijke stappen om CRISPR-Cas9-mutaties in maternale-effectgenen te creëren en het overeenkomstige fenotype te identificeren met behulp van een maternale crispantbenadering (figuur 1). In sectie één wordt uitgelegd hoe u effectief gids-RNA's kunt ontwerpen en maken, terwijl secties twee en drie kritieke stappen bevatten voor het maken van maternale crispants door micro-injectie. Na het injecteren van het CRISPR-Cas9 mengsel worden geïnjecteerde embryo's gescreend op somatische bewerkingen via PCR (sectie vier). Zodra de geïnjecteerde F0-embryo's zich ontwikkelen en geslachtsrijp zijn, worden de F0-vrouwtjes gekruist met mannetjes van het wilde type en worden hun nakomelingen gescreend op fenotypen met maternale effecten (sectie vijf). Sectie zes bevat instructies voor het maken van maternale crispante haploïden die kunnen worden gecombineerd met Sanger-sequencing om de CRISPR-Cas9-geïnduceerde INDELs te identificeren. Daarnaast bevat de discussie wijzigingen die in het protocol kunnen worden aangebracht om de gevoeligheid en kracht van deze methode te vergroten.

determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants

Vroege ontwikkeling hangt af van een pool van maternale factoren die tijdens oogenese in de volwassen eicel zijn opgenomen en die alle cellulaire functies uitvoeren die nodig zijn voor de ontwikkeling tot zygotische genoomactivering. Typisch vereist genetische targeting van deze maternale factoren een extra generatie om fenotypen met maternale effecten te identificeren, waardoor het vermogen om de rol van maternale tot expressie gebrachte genen tijdens de ontwikkeling te bepalen, wordt belemmerd. De ontdekking van de biallelische bewerkingsmogelijkheden van CRISPR-Cas9 heeft screening van embryonale fenotypes in somatische weefsels van geïnjecteerde embryo's of "crispants" mogelijk gemaakt, waardoor het begrip van de rol die zygotisch tot expressie gebrachte genen spelen in ontwikkelingsprogramma's wordt vergroot. Dit artikel beschrijft een protocol dat in het verlengde ligt van de crispantmethode. In deze methode maakt de biallelische bewerking van geslachtscellen de isolatie van een fenotype met moedereffect in een enkele generatie mogelijk, of "maternale crispants". Multiplexing leidt RNA's naar een enkel doelwit bevordert de efficiënte productie van maternale crispants, terwijl sequentieanalyse van maternale crispant haploïden een eenvoudige methode biedt om genetische laesies te bevestigen die een fenotype met maternale effecten produceren. Het gebruik van maternale crispants ondersteunt de snelle identificatie van essentiële maternale tot expressie gebrachte genen, waardoor het begrip van vroege ontwikkeling wordt vergemakkelijkt.

De experimentele aanpak die in dit protocol wordt beschreven, maakt het mogelijk om fenotypen met maternale effecten op een snelle, hulpbronnenefficiënte manier te identificeren (figuur 1).
Het genereren van maternale crispants: Bij het ontwerpen van de vier gids-RNA's om zich te richten op een enkel kandidaat-gen met moedereffect, moet speciale aandacht worden besteed aan waar de gids-RNA's aan DNA zullen binden. Over het algemeen moeten ze a...

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants at JoVE.com

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Vroege ontwikkeling is afhankelijk van moederlijk overgeërfde producten en de rol van veel van deze producten is momenteel onbekend. Hierin beschreven we een protocol dat CRISPR-Cas9 gebruikt om fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.

Het bepalen van de rol van maternale tot expressie gebrachte genen in de vroege ontwikkeling met maternale crispants

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

De rol van veel maternale tot expressie gebrachte genen tijdens de vroege ontwikkeling is momenteel onbekend. Deze maternale CRISPR-techniek maakt de snelle identificatie van maternale effectgenen en hun rol in de ontwikkeling mogelijk. Multiplexing leidt RNA's naar een enkel gen, stelt onderzoekers in staat om nieuwe fenotypen met maternale effecten in een enkele generatie te identificeren.Dit onderzoek is nuttig om de functie van mRNA-transcripten in de gameten te begrijpen, die nodig zijn voor vroege embryogenese. De sleutel tot deze techniek is om de embryo's vroeg in het stadium van één cel te micro-injecteren en te controleren of de meerderheid van de gids RNA's somatische mutaties in de geïnjecteerde embryo's kunnen maken. Om een gids-RNA-sjabloon te maken voor elk genspecifiek oligonucleotide, analyt naar het constante oligonucleotide en vul de overhangen op met T4 DNA-polymerase.Nadat de vier gids-RNA-sjablonen zijn samengesteld, zuivert en concentreert u ze samen met behulp van een DNA-opruimings- en concentratorkit. Synthetiseer het sgRNA-mengsel uit de gepoolde guy RNA-sjabloon, met behulp van een in-vitro T7-transcriptiekit, en voer de in-vitro transcriptie uit zoals beschreven in het manuscript. Om de integriteit van het sgRNA te verifiëren, giet je een 1% agarose 0,5 microgram per milliliter, ethidiumbromide Tris-Borate-EDTA-gel.Plaats de gestolde gel in Tris-Borate-EDTA loopbuffer. Meng één microliter sgRNA-mengsel en één microliter RNA-gellaadbuffer. Laad dit monster in de gel en laat de gel vijf minuten op 100 volt draaien.Visualiseer de banden met ultraviolet licht. Zet wild type kruisen en zebravis paring dozen. Houd de mannelijke en vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met behulp van een paringsdoosverdeler, of zoals hier afgebeeld, door het vrouwtje in een ei-leggende insert te plaatsen.Nadat de injectiecocktail is samengesteld, laat u het mannetje en het vrouwtje paren door de paringskastverdeler te verwijderen, of zoals hier afgebeeld, door het mannetje in dezelfde eilegplaats te plaatsen als het vrouwtje. Om de embryo's te synchroniseren, verzamelt u ze na 10 minuten met een plastic zeef en spoelt u ze in een petrischaal met behulp van 1XE3-media. Verwijder 10 tot 15 embryo's en plaats ze in een aparte petrischaal om als niet-geïnjecteerde controles te worden bewaard.Breng de resterende embryo's over in de injectieplaatputten. Injecteer één nanoliter eiwit sgRNA-oplossing in de zich ontwikkelende blastoschijf van een eencellig embryo. Gebruik een tang om de punt van de verstopte naald te breken en kalibreer de naald opnieuw om een bolus van één nanoliter uit te werpen.Verzamel de volgende dag na de injectie zes gezond geïnjecteerde embryo's en twee controleembryo's van de niet-geïnjecteerde plaat. Plaats elk embryo afzonderlijk in een enkele put van een PCR-stripbuis en label de bovenkant van de buizen. Ontwerp unieke screeningprimers voor elke gidslocatie om een 100 tot 110 base paired DNA-fragment te versterken dat de CRISPR-Cas9-doellocatie bevat.Plaats indien mogelijk de doellocatie in het midden van het versterkte fragment, zodat grotere deleties kunnen worden geïdentificeerd. Stel voor elk van de vier richtlocaties acht PCR-reacties van 25 microliter in met behulp van vijf microliter van het bereide enkele embryogenomische DNA en 20 microliter van de PCR-mix, en begeleid specifieke screeningprimersmengsel, om somatische mutaties in de doellocatie te identificeren. Giet een 2,5% agarose, 0,5 microgram per milliliter ethidiumbromide Tris-Borate-EDTA-gel met behulp van kammen die ongeveer 0,625 centimeter brede putten creëren.Plaats vervolgens de gestolde gel in de elektroforesekamer met Tris-Borate-EDTA-loopbuffer. Voeg vijf microliter 6X ladende kleurstof toe aan het PCR-product. Laad 25 microliter van dit mengsel in de gel en zorg ervoor dat de geïnjecteerde en controlemonsters op dezelfde gelrij draaien.Nadat alle monsters zijn geladen, voegt u vijf microliter ethidiumbromide per liter Tris-Borate-EDTA-loopbuffer toe aan het positieve uiteinde van de gelbox. Laat de gel op 120 volt draaien totdat het DNA-verbod is verdwenen of het DNA het einde van de rijstrook heeft bereikt. Om de fenotypen met maternale effecten en de embryo's van maternale CRISPR te identificeren, zet u de F0-geïnjecteerde vrouwtjes op tegen mannetjes van het wilde type en controleert u wilde typekruisen in standaard zebravisparingsdozen tijdens de middag voorafgaand aan het experiment.Plaats de mannelijke en vrouwelijke vissen in dezelfde tank, maar scheid ze met een paringsdoosverdeler of plaats het vrouwtje in een eilegplaats. Laat op de ochtend van het experiment het mannetje en het vrouwtje beginnen met paren door de paringsdoosverdeler te verwijderen of het mannetje in dezelfde ei-leggende insert te plaatsen als het vrouwtje. Verzamel de embryo's elke 10 minuten door de ei-leggende insert in een nieuwe paringstankbodem te verplaatsen die vers systeemwater bevat en label de tank met een tag die het individuele F0-vrouwtje identificeert.Neem de oude paringstank en giet het water door een T-zeef om de embryo's te verzamelen uit één individuele koppeling van 10 minuten. Observeer onder een ontleedmicroscoop met een transcendente lichtbron de embryo's die elk uur in ontwikkeling zijn, gedurende de eerste zes tot acht uur en dagelijks gedurende de volgende vijf dagen. Verplaats de potentiële maternale CRISPR-embryo's naar een petrischaal die 1XE3-media bevat en test op morfologisch fenotype 24 uur na de bevruchting en levensvatbaarheid, vijf dagen na de bevruchting.De middag voor het experiment, stel paringsparen van F0-vrouwtjes op door de wilde mannetjes fysiek gescheiden te houden van de vrouwtjes, een paringsdoosverdeler te gebruiken of het vrouwtje in de eierleggende insert te plaatsen. Verwijder op de ochtend van het experiment de fysieke partitie om de paring te starten. Bij het eerste teken van het leggen van eieren, onderbreek het fokken door de mannelijke en F0-vrouwtjes te scheiden en houd elk gescheiden F0-vrouwtje in individuele paringsboxen.Laat na in-vitrofertilisatie de haploïde embryo's zich ontwikkelen totdat het maternale CRISPR-fenotype wordt waargenomen en plaats die embryo's in een andere petrischaal. Zodra de maternale CRISPR haploïde embryo's zijn geïdentificeerd, laat ze zich ontwikkelen gedurende ten minste zes uur na de bevruchting. Om het genomische DNA uit ten minste 10 maternale CRISPR haploïde embryo's te extraheren, plaatst u een enkel haploïde embryo in een individuele put van een PCR-stripbuis, verwijdert u overtollige E3-media uit de put en voegt u 50 microliter 50 millimolaire natriumhydroxide toe.Incubeer de embryo's gedurende 20 minuten bij 95 graden Celsius en koel ze af tot vier graden Celsius. Voeg vervolgens vijf microliter van één molair Tris-zoutzuur met pH 7,5 toe en vortex gedurende vijf tot 10 seconden. Om te bepalen welke gidssites indels bevatten, ontwerpt u sequencingprimers om een DNA-fragment te versterken, inclusief alle vier CRISPR / Cas9-doellocaties.Stel twee 25 microliter PCR-reacties per embryo in, met behulp van vijf microliter van het bereide genomische DNA en de sequencingprimers. Nadat de PCR is voltooid, zuivert en concentreert u de twee monsters met behulp van een DNA-opruimings- en concentratorkit en verzendt u het DNA-fragment naar Sanger-sequencing, met behulp van de voor- en achteruitvolgingsprimers. Gids-RNA's moeten allemaal worden geclusterd met minimale tot geen overlappende regio's tussen gids-RNA's tijdens het genereren van MATERNALE CRISPR.Als er indels werden gemaakt, moet een uitstrijkje worden waargenomen in de geïnjecteerde monsters op een agarose-gel, maar niet in de niet-geïnjecteerde controle. De maternale CRISPR-methode kan worden gebruikt voor fenocopie van bekende maternale effectmutaties, zoals bont, tmi en aura. Om de genetische laesies te identificeren die bijdragen aan het maternale CRISPR-fenotype, worden UV-behandeld sperma en in-vitrofertilisatie gecombineerd om maternale CRISPR-haploïden te creëren.De creatie van een haploïde maakt Sanger-sequencing van het maternale allel en identificatie van maternale CRISPR-indels mogelijk. Bij het identificeren van een onmateaal effectfenotype, is het essentieel dat u het bij meerdere F0-vrouwen kunt waarnemen, omdat het de kans vergroot dat het fenotype wordt veroorzaakt door functieverlies, niet door off-target of niet-specifieke effecten. Nadat een fenotype met maternale effecten is geïdentificeerd, kunnen de maternale CRISPR-embryo's worden gebruikt om de effecten op verschillende aspecten van vroege embryogenese te onderzoeken, zoals het sinusskelet of DNA-segregatie.Hierdoor kunnen onderzoekers de moleculaire oorzaak van het fenotype begrijpen. Deze methode test direct de functie van onbekende moederlijk tot expressie gebrachte genen in een enkele generatie, waardoor ons begrip van processen wordt versneld en tijdens vroege embryogenese wordt gewerkt.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Het gebruik van Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) voor het bestuderen van genen en Promoters Betrokken bij Wood Vorming en secundaire Stem Development

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Tools om de rol van de Architectural eiwit HMGB1 Bestudeer in de verwerking van Helix vervormen, site-specifieke DNA InterStrand Crosslinks

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Voorbereiding van de rAAV9 tot overexpressie of Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

gerichte<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese van histon genen in gist

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Real-time analyse van transcriptiefactor bindend, transcriptie, vertaling en omzet globale u gebeurtenissen wilt weergeven tijdens de activatie van de cellulaire

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

De rol van zelfkopiërende plasmiden testen in de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

Kandidaat-gen in klinische cohortstudies met Multiplexed genotypering en massaspectrometrie testen

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qKAT: kwantitatieve Semi-automated te typen van Killer-cel immunoglobuline-achtig Receptor genen

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Bepaling van het tarief van de bevruchting ei van Bemisia tabaci met behulp van een cytogenetische techniek

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...