Name: determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00
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Wir danken ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der Tierhaltung des Pelegri Labors für ihre Pflege der Wasseranlage. Wir sind auch dankbar für die Kommentare und Einblicke in das Manuskript von Ryan Trevena und Diane Hanson. Die Finanzierung erfolgte durch NIH-Zuschuss an F.P. (GM065303)

In Studien, die zur Entwicklung dieses Protokolls führten, wurden alle Zebrafischhaltungen und Experimente vom University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2) genehmigt.
1. Synthese von Guide-RNAs
HINWEIS: Zygotische Crispants wurden unter Verwendung einer einzigen Guide-RNA oder des Multiplexens mehrerer Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel 5,6,7,8,9,10 hergestellt.<sup c...

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	<li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+factors+in+zebrafish+development.">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li><li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis.">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), 2996-3008 (2015).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li><li>He, W. -. 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I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish.">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li><li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants.">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), 199536 (2021).</li><li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells:+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA.">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li><li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+segregation,+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo.">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li><li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3'UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish.">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li><li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells.">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li><li>Gagnon, J. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR/Cas9+zebrafish+mutant+screening.">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. 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E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos.">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. 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(89), e51708 (2014).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), 2955-2967 (2005).</li><li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., G&#246;mann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish.">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li></ol>

Das in diesem Manuskript vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und primäre molekulare Charakterisierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation anstelle der mehreren Generationen, die für vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken erforderlich sind. Derzeit ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene unbekannt. Dieser Mangel an Wissen ist zum Teil auf die zusätzliche Generation zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen Phänotyp bei der Identifizierung von Genen m...

Ein Pool von mütterlich abgelagerten Produkten (z. B. RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) ist für alle frühen zellulären Prozesse notwendig, bis das zygotische Genom des Embryos aktiviert ist1. Die vorzeitige Erschöpfung dieser Produkte aus der Eizelle ist typischerweise embryonal tödlich. Trotz der Bedeutung dieser Gene für die Entwicklung ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene derzeit unbekannt. Fortschritte in der Gen-Editing-Technologie bei Zebrafischen, wie CRISPR-Cas9, ermöglichen das Targeting von maternal exprimierten Genen 2,3,4. Die Identifizierung eines mütterlichen Phänotyps erfordert jedoch eine zusätzliche Generation im Vergleich zu einem zygotischen Phänotyp und erfordert daher mehr Ressourcen. Vor kurzem wurde die biallelische Bearbeitungsfähigkeit von CRISPR-Cas9 genutzt, um nach embryonalen Phänotypen in somatischen Geweben injizierter (F0) Embryonen, bekannt als "Crispants"5,6,7,8,9,10, zu suchen. Die Crispant-Technik ermöglicht ein ressourceneffizientes Screening von Kandidatengenen in somatischen Zellen und erleichtert so das Verständnis spezifischer Aspekte in der Entwicklung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von mütterlichen Effekt-Phänotypen oder "maternalen Crispants" in einer einzigen Generation11. Dieses Schema ist erreichbar, indem Guide-RNAs auf ein einzelnes Gen gemultiplext und biallelische Editierereignisse in der Keimbahn gefördert werden. Diese mütterlichen Crispant-Embryonen können durch grobe morphologische Phänotypen identifiziert werden und einer primären Charakterisierung unterzogen werden, wie z. B. Markierung für Zellgrenzen und DNA-Musterung11. Die kombinierte Analyse des beobachtbaren Phänotyps und die grundlegende molekulare Charakterisierung der induzierten INDELs ermöglichen die Vorhersage der Rolle des Zielgens in der frühen Entwicklung.
Im Zebrafisch entwickelt sich während der ersten 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) eine kleine Gruppe von Zellen zu den primordialen Keimzellen, einem Vorläufer der Keimbahn12,13,14,15. In Gelege von F0-Weibchen hängt der Anteil der gewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen davon ab, wie viele Keimzellen ein biallelisches Editierungsereignis im Zielgen enthalten. Im Allgemeinen gilt: Je früher das Bearbeitungsereignis im Embryo auftritt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR-Cas9-Mutationen in der Keimbahn beobachtet werden. In den meisten Fällen stammen die Phänotypen mütterlicher Crispant-Embryonen aus dem Funktionsverlust der beiden mütterlichen Allele, die in der sich entwickelnden Eizelle vorhanden sind. Wenn die Eizelle die Meiose beendet, wird eines der mütterlichen Allele über den Polkörper aus dem Embryo extrudiert, während das andere Allel in den mütterlichen Vorkern eingebaut wird. Die Sequenzierung mehrerer mütterlicher Crispant-Haploide stellt eine Mischung der in der Keimbahn vorhandenen Mutationen (Insertionen und/oder Deletionen (INDELs)) dar, die zum Phänotyp11 beitragen.
Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Erzeugung von CRISPR-Cas9-Mutationen in maternalen Effektgenen und zur Identifizierung des entsprechenden Phänotyps mit einem mütterlichen Crispant-Ansatz (Abbildung 1). Abschnitt eins wird erklären, wie man Guide-RNAs effektiv entwirft und erstellt, während die Abschnitte zwei und drei kritische Schritte zur Herstellung mütterlicher Crispants durch Mikroinjektion enthalten. Nach der Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung werden die injizierten Embryonen mittels PCR auf somatische Schnitte untersucht (Abschnitt vier). Sobald sich die injizierten F0-Embryonen entwickeln und die Geschlechtsreife erreichen, werden die F0-Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt, und ihre Nachkommen werden auf mütterliche Phänotypen untersucht (Abschnitt fünf). Abschnitt sechs enthält Anweisungen zur Herstellung mütterlicher Crispant-Haploide, die mit der Sanger-Sequenzierung kombiniert werden können, um die CRISPR-Cas9-induzierten INDELs zu identifizieren. Darüber hinaus enthält die Diskussion Änderungen, die am Protokoll vorgenommen werden können, um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit dieser Methode zu erhöhen.

determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants

Die frühe Entwicklung hängt von einem Pool mütterlicher Faktoren ab, die während der Oogenese in die reife Eizelle eingebaut werden und alle für die Entwicklung notwendigen zellulären Funktionen bis zur Aktivierung des zygotischen Genoms erfüllen. Typischerweise erfordert das genetische Targeting dieser mütterlichen Faktoren eine zusätzliche Generation, um Phänotypen mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, was die Fähigkeit behindert, die Rolle von maternal exprimierten Genen während der Entwicklung zu bestimmen. Die Entdeckung der biallelischen Editierfähigkeiten von CRISPR-Cas9 hat das Screening embryonaler Phänotypen in somatischen Geweben injizierter Embryonen oder "Crispants" ermöglicht und das Verständnis der Rolle zygotisch exprimierter Gene in Entwicklungsprogrammen erweitert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das eine Erweiterung der Crispant-Methode darstellt. Bei dieser Methode ermöglicht die biallelische Bearbeitung von Keimzellen die Isolierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation oder "mütterlichen Crispants". Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel fördert die effiziente Produktion von mütterlichen Crispants, während die Sequenzanalyse von mütterlichen Crispant-Haploiden eine einfache Methode zur Bestätigung genetischer Läsionen bietet, die einen mütterlichen Phänotyp erzeugen. Die Verwendung von mütterlichen Crispants unterstützt die schnelle Identifizierung essentieller maternal exprimierter Gene und erleichtert so das Verständnis der frühen Entwicklung.

Der in diesem Protokoll beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht die schnelle und ressourcenschonende Identifizierung mütterlicher Effektphänotypen (Abbildung 1).
Erzeugung von mütterlichen Knuspern: Bei der Entwicklung der vier Guide-RNAs für ein einzelnes Kandidaten-Gen mit mütterlichem Effekt sollte besonders berücksichtigt werden, wo die Guide-RNAs an DNA binden. Im Allgemeinen sollten sie alle zusammen mit minimalen bis keinen ...

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Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene während der frühen Entwicklung ist derzeit unbekannt. Diese mütterliche CRISPR-Technik ermöglicht die schnelle Identifizierung von mütterlichen Effektgenen und ihrer Rolle bei der Entwicklung. Multiplexing führt RNAs zu einem einzigen Gen, ermöglicht es Forschern, neue mütterliche Effekt-Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.Diese Forschung ist nützlich, um die Funktion von mRNA-Transkripten in den Gameten zu verstehen, die für die frühe Embryogenese notwendig sind. Der Schlüssel zu dieser Technik besteht darin, die Embryonen früh im Einzellstadium zu injizieren und zu überprüfen, ob die Mehrheit der Guide-RNAs somatische Mutationen in den injizierten Embryonen verursachen kann. Um eine RNA-Leitvorlage für jedes genspezifische Oligonukleotid zu erstellen, analytieren Sie das konstante Oligonukleotid und füllen Sie die Überhänge mit T4-DNA-Polymerase.Nachdem die vier Guide-RNA-Templates zusammengesetzt sind, reinigen und konzentrieren Sie sie zusammen mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit. Synthetisieren Sie die sgRNA-Mischung aus der gepoolten Guy-RNA-Vorlage unter Verwendung eines In-vitro-T7-Transkriptionskits und führen Sie die In-vitro-Transkription wie im Manuskript beschrieben durch. Um die Integrität der sgRNA zu überprüfen, gießen Sie ein 1% Agarose 0,5 Mikrogramm pro Milliliter, Ethidiumbromid Tris-Borat-EDTA-Gel.Legen Sie das verfestigte Gel in Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer. Mischen Sie eine Mikroliter-sgRNA-Mischung und einen Mikroliter-RNA-Gel-Ladepuffer. Laden Sie diese Probe in das Gel und lassen Sie das Gel fünf Minuten lang bei 100 Volt laufen.Visualisieren Sie die Bänder mit ultraviolettem Licht. Stellen Sie Wildtypkreuzungen und Zebrafisch-Paarungsboxen auf. Halten Sie den männlichen und den weiblichen Fisch im selben Tank, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastenteiler oder wie hier gezeigt, indem Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz legen.Nachdem der Injektionscocktail zusammengesetzt ist, lassen Sie das Männchen und das Weibchen paaren, indem Sie den Trennkastenteiler entfernen oder, wie hier gezeigt, indem Sie das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen. Um die Embryonen zu synchronisieren, sammeln Sie sie nach 10 Minuten mit einem Kunststoffsieb und spülen Sie sie mit 1XE3-Medien in eine Petrischale aus. Entfernen Sie 10 bis 15 Embryonen und legen Sie sie in eine separate Petrischale, um sie als nicht injizierte Kontrollen aufzubewahren.Die restlichen Embryonen werden in die Vertiefungen der Injektionsplatte überführt. Injizieren Sie eine Nanoliter-Protein-sgRNA-Lösung in die sich entwickelnde Blastoscheibe eines einzelligen Embryos. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Spitze der verstopften Nadel zu brechen, und kalibrieren Sie die Nadel neu, um einen Ein-Nanoliter-Bolus auszustoßen.Am nächsten Tag nach der Injektion sechs gesunde injizierte Embryonen und zwei Kontrollembryonen von der nicht injizierten Platte entnehmen. Legen Sie jeden Embryo einzeln in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens und beschriften Sie die Oberseite der Röhrchen. Entwerfen Sie einzigartige Screening-Primer für jede Guide-Site, um ein 100 bis 110 Basen-gepaartes DNA-Fragment zu amplifizieren, das die CRISPR-Cas9-Zielstelle enthält.Wenn möglich, platzieren Sie die Zielstelle in der Mitte des amplifizierten Fragments, um größere Deletionen zu identifizieren. Richten Sie für jede der vier Leitzielstellen acht 25-Mikroliter-PCR-Reaktionen unter Verwendung von fünf Mikrolitern der vorbereiteten einzelnen embryogenomischen DNA und 20 Mikrolitern der PCR-Mischung ein und leiten Sie spezifische Screening-Primer-Mischungen, um somatische Mutationen in der Zielstelle zu identifizieren. Gießen Sie ein 2,5% Agarose, 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid Tris-Borat-EDTA-Gel mit Kämmen, die etwa 0,625 Zentimeter breite Vertiefungen erzeugen.Anschließend wird das erstarrte Gel in die Elektrophoresekammer gegeben, die Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer enthält. Fügen Sie dem PCR-Produkt fünf Mikroliter 6X-Ladefarbstoff hinzu. Laden Sie 25 Mikroliter dieser Mischung in das Gel, um sicherzustellen, dass die injizierten und Kontrollproben auf derselben Gelreihe laufen.Nachdem alle Proben geladen sind, fügen Sie fünf Mikroliter Ethidiumbromid pro Liter Tris-Borat-EDTA-Laufpuffer zum positiven Ende der Gelbox hinzu. Lassen Sie das Gel mit 120 Volt laufen, bis sich die DNA-Verbote auflösen oder die DNA sich dem Ende der Spur genähert hat. Um die mütterlichen Effektphänotypen und die mütterlichen CRISPR-Embryonen zu identifizieren, richteten Sie die injizierten F0-Weibchen gegen Wildtyp-Männchen ein und kontrollierten Wildtypkreuzungen in Standard-Zebrafisch-Paarungsboxen am Nachmittag vor dem Experiment.Setzen Sie den männlichen und weiblichen Fisch in dasselbe Becken, aber trennen Sie sie mit einem Paarungskastentrenner oder legen Sie das Weibchen in einen Eiablageeinsatz. Lassen Sie das Männchen und das Weibchen am Morgen des Experiments mit der Paarung beginnen, indem Sie den Trennkasten entfernen oder das Männchen in den gleichen Eiablageeinsatz wie das Weibchen legen. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten, indem Sie den Eiablageeinsatz in einen neuen Paarungstankboden bewegen, der frisches Systemwasser enthält, und den Tank mit einem Etikett beschriften, das das einzelne F0-Weibchen identifiziert.Nehmen Sie das alte Paarungsbecken und gießen Sie das Wasser durch ein T-Sieb, um die Embryonen von einem einzelnen 10-Minuten-Gelege zu sammeln. Beobachten Sie unter einem Seziermikroskop mit einer transzendenten Lichtquelle die Entwicklung der Embryonen jede Stunde, in den ersten sechs bis acht Stunden und täglich in den nächsten fünf Tagen. Bringen Sie die potenziellen mütterlichen CRISPR-Embryonen in eine Petrischale, die 1XE3-Medien enthält, und testen Sie den morphologischen Phänotyp 24 Stunden nach der Befruchtung und die Lebensfähigkeit fünf Tage nach der Befruchtung.Stellen Sie am Nachmittag vor dem Experiment Paarungspaare von F0-Weibchen auf, indem Sie die Wildtyp-Männchen physisch von den Weibchen trennen, einen Paarungskastenteiler verwenden oder das Weibchen in den Eiablageeinsatz legen. Entfernen Sie am Morgen des Experiments die physische Trennwand, um die Paarung einzuleiten. Beim ersten Anzeichen einer Eiablage unterbrechen Sie die Brut, indem Sie das Männchen und das F0-Weibchen trennen, und halten Sie jedes getrennte F0-Weibchen in einzelnen Paarungsboxen.Lassen Sie nach der In-vitro-Fertilisation die haploiden Embryonen sich entwickeln, bis der mütterliche CRISPR-Phänotyp beobachtet ist, und legen Sie diese Embryonen in eine andere Petrischale. Sobald die mütterlichen haploiden CRISPR-Embryonen identifiziert wurden, lassen Sie sie mindestens sechs Stunden nach der Befruchtung entwickeln. Um die genomische DNA aus mindestens 10 mütterlichen haploiden CRISPR-Embryonen zu extrahieren, legen Sie einen einzelnen haploiden Embryo in eine einzelne Vertiefung eines PCR-Streifenröhrchens, entfernen Sie überschüssige E3-Medien aus der Vertiefung und fügen Sie 50 Mikroliter 50 Millimolar-Natriumhydroxid hinzu.Inkubieren Sie die Embryonen für 20 Minuten bei 95 Grad Celsius und kühlen Sie sie auf vier Grad Celsius ab. Dann fügen Sie fünf Mikroliter einer molaren Tris-Salzsäure mit pH 7,5 hinzu und wirbeln Sie für fünf bis 10 Sekunden. Um zu identifizieren, welche Leitstellen Indels enthalten, entwerfen Sie Sequenzierungsprimer, um ein DNA-Fragment einschließlich aller vier CRISPR/Cas9-Zielstellen zu amplifizieren.Richten Sie zwei 25 Mikroliter PCR-Reaktionen pro Embryo ein, wobei fünf Mikroliter der vorbereiteten genomischen DNA und die Sequenzierungsprimer verwendet werden. Nachdem die PCR abgeschlossen ist, reinigen und konzentrieren Sie die beiden Proben mit einem DNA-Aufreinigungs- und Konzentrator-Kit und reichen das DNA-Fragment unter Verwendung der Vorwärts- und Rückwärtssequenzierungsprimer an die Sanger-Sequenzierung ein. Guide-RNAs sollten alle zusammen mit minimalen bis keinen überlappenden Regionen zwischen Guide-RNAs während der mütterlichen CRISPR-Erzeugung geclustert werden.Wenn Indels erzeugt wurden, sollte ein Abstrich in den injizierten Proben auf einem Agarosegel beobachtet werden, nicht jedoch in der nicht injizierten Kontrolle. Die mütterliche CRISPR-Methode kann verwendet werden, um bekannte mütterliche Effektmutationen wie Kunterbunt, TMI und Aura zu phänokopieren. Um die genetischen Läsionen zu identifizieren, die zum mütterlichen CRISPR-Phänotyp beitragen, werden UV-behandelte Spermien und In-vitro-Fertilisation kombiniert, um mütterliche CRISPR-Haploiden zu erzeugen.Die Schaffung eines haploiden Prozesses ermöglicht die Sanger-Sequenzierung des mütterlichen Allels und die Identifizierung mütterlicher CRISPR-Indels. Bei der Identifizierung eines unmaternalen Effektphänotyps ist es wichtig, dass Sie ihn bei mehreren F0-Frauen beobachten können, da dies die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass der Phänotyp durch Funktionsverlust verursacht wird, nicht durch Ziel- oder unspezifische Effekte. Nachdem ein mütterlicher Effektphänotyp identifiziert wurde, können die mütterlichen CRISPR-Embryonen verwendet werden, um die Auswirkungen auf verschiedene Aspekte der frühen Embryogenese, wie das Sinusskelett oder die DNA-Segregation, zu untersuchen.Dies ermöglicht es den Forschern, die molekulare Ursache des Phänotyps zu verstehen. Diese Methode testet direkt die Funktion unbekannter mütterlich exprimierter Gene in einer einzigen Generation und beschleunigt unser Verständnis von Prozessen, die während der frühen Embryogenese wirken.

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

Die Verwendung von Induced Somatic Sektoranalyse (IVSS) in Holzbildung und Nebenschaft Entwicklung beteiligten Gene und Promotoren Studieren

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Forschung

Genetik

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Tools, um die Rolle der Architektur-Protein HMGB1 zur Untersuchung bei der Verarbeitung von Helix verzerrenden, ortsspezifische DNA-Quervernetzungen zwischen

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Herstellung von rAAV9 überexprimiert oder Sturz Gene in Mäuseherzen

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

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Gezielt<em&gt; In Situ</em&gt; Mutagenese von Histon-Gene in Bäckerhefe

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