Name: determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00
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हम जलीय सुविधा की देखभाल के लिए पिछले और वर्तमान पेलेगरी प्रयोगशाला पशुपालन कर्मचारियों के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम रयान ट्रेवेना और डायने हैनसन द्वारा पांडुलिपि पर टिप्पणियों और अंतर्दृष्टि के लिए भी आभारी हैं। एफ.पी. (जीएम065303) को एनआईएच अनुदान द्वारा वित्त पोषण प्रदान किया गया था।

इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए अग्रणी अध्ययनों में, सभी ज़ेब्राफिश आवास और प्रयोगों को विस्कॉन्सिन-मैडिसन संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी-एम005268-आर 2) विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गय?...

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	<li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+factors+in+zebrafish+development.">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li><li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis.">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), 2996-3008 (2015).</li><li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aura+(mid1ip1l)+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition.">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).</li><li>He, W. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte-specific+maternal+Slbp2+is+required+for+replication-dependent+histone+storage+and+early+nuclear+cleavage+in+zebrafish+oogenesis+and+embryogenesis.">Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis.</a> RNA. 24 (12), 1738-1748 (2018).</li><li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes.">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).</li><li>Jao, L. -. E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system.">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li><li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish.">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li><li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens.">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li><li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+CRISPR/Cas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function.">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).</li><li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish.">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li><li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants.">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), 199536 (2021).</li><li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells:+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA.">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li><li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation,+segregation,+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo.">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li><li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3'UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish.">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li><li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells.">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).</li><li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs.">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v2:+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering.">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li><li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP:+a+CRISPR/Cas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing.">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li><li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish.">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 377-392 (2019).</li><li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish.">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860 (2017).</li><li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition.">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li><li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ensembl+gene+annotation+system.">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li><li>Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+and+identification+of+CRISPR/Cas9-generated+gene+knockouts+in+the+model+system+Danio+rerio.">Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).</li><li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs,+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish.">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).</li><li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function.">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).</li><li>Xu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microinjection+into+zebrafish+embryos.">Microinjection into zebrafish embryos.</a> Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).</li><li>Biology Mouse, ., Zebrafish, , Chick, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology:+Mouse,+Zebrafish,+and+Chick.+Zebrafish+Microinjection+Techniques.">Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques.</a> JoVE Science Education Database. , (2021).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>D'Agostino, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+cheap+methodology+for+CRISPR/Cas9+zebrafish+mutant+screening.">A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening.</a> Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).</li><li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment.">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).</li><li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes.">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li><li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos.">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li><li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization.">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).</li><li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection.">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), 2955-2967 (2005).</li><li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., G&#246;mann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish.">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li><li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPRscan:+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo.">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li></ol>

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रोटोकॉल आगे और रिवर्स आनुवंशिक तकनीकों दोनों के लिए आवश्यक कई पीढ़ियों के बजाय एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान और प्राथमिक आणविक लक्षण वर्णन की अनुमति देता है।...

मातृ जमा उत्पादों (जैसे, आरएनए, प्रोटीन और अन्य बायोमोलेक्यूल्स) का एक पूल सभी प्रारंभिक सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक है जब तक कि भ्रूण का युग्मनजजीनोम सक्रिय नहीं हो जाता है। अंडाणु से इन उत्पादों की समय से पहले कमी आमतौर पर भ्रूण घातक होती है। विकास में इन जीनों के महत्व के बावजूद, कई मातृ-व्यक्त जीनों की भूमिका वर्तमान में अज्ञात है। जेब्राफिश में जीन-संपादन तकनीक में प्रगति, जैसे कि सीआरआईएसपीआर-कैस 9, मातृ-व्यक्त जीन 2,3,4 के लक्ष्यीकरण को सक्षम बनाता है। हालांकि, एक मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान के लिए एक युग्मनज फेनोटाइप की तुलना में एक अतिरिक्त पीढ़ी की आवश्यकता होती है, इस प्रकार अधिक संसाधनों की आवश्यकता होती है। हाल ही में, CRISPR-Cas9 की द्विस्तरीय संपादन क्षमता का उपयोग इंजेक्शन (F0) भ्रूण के दैहिक ऊतकों में भ्रूण फेनोटाइप ्स के लिए स्क्रीन करने के लिए किया गया है, जिसे "क्रिस्पेंट" 5,6,7,8,9,10 के रूप में जाना जाता है। क्रिस्पेंट तकनीक दैहिक कोशिकाओं में उम्मीदवार जीन की संसाधन-कुशल स्क्रीनिंग की अनुमति देती है, जिससे विकास में विशिष्ट पहलुओं को समझने में सुविधा होती है। इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल एक पीढ़ी11 में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप, या "मातृ क्रिस्पेंट" की पहचान के लिए अनुमति देता है। यह योजना मल्टीप्लेक्सिंग गाइड आरएनए को एक जीन में शामिल करके और जर्मलाइन में द्विवार्षिक संपादन घटनाओं को बढ़ावा देकर प्राप्त की जा सकती है। इन मातृ क्रिस्पेंट भ्रूणों को सकल रूपात्मक फेनोटाइप्स द्वारा पहचाना जा सकता है और प्राथमिक लक्षण वर्णन से गुजरना पड़ता है, जैसे कि सेल सीमाओं के लिए लेबलिंग और डीएनए पैटर्निंग11। प्रेरित आईएनडीईएल के अवलोकन योग्य फेनोटाइप और बुनियादी आणविक लक्षण वर्णन का संयुक्त विश्लेषण प्रारंभिक विकास में लक्षित जीन की भूमिका की भविष्यवाणी के लिए अनुमति देता है।
ज़ेबराफ़िश में, पहले 24 घंटे पोस्ट-फर्टिलाइजेशन (एचपीएफ) के दौरान, कोशिकाओं का एक छोटा समूह आदिम रोगाणु कोशिकाओं में विकसित होता है, जो जर्मलाइन 12,13,14,15 का अग्रदूत है। एफ 0 मादाओं द्वारा रखे गए चंगुल में, बरामद मातृ कुरकुरा भ्रूण का अनुपात इस बात पर निर्भर करता है कि कितनी रोगाणु कोशिकाओं में लक्षित जीन में एक द्विगुण संपादन घटना होती है। सामान्य तौर पर, भ्रूण में जितनी जल्दी संपादन घटना होती है, जर्मलाइन में सीआरआईएसपीआर-कैस 9 उत्परिवर्तन देखे जाने की संभावना उतनी ही अधिक होती है। ज्यादातर मामलों में, मातृ क्रिस्पेंट भ्रूण के फेनोटाइप विकासशील अंडाणु में मौजूद दो मातृ एलील में कार्य के नुकसान से आते हैं। जैसे ही अंडाणु अर्धसूत्रीविभाजन को समाप्त करता है, मातृ एलील्स में से एक को ध्रुवीय शरीर के माध्यम से भ्रूण से बाहर निकाला जाता है, जबकि दूसरा एलील मातृ प्रोन्यूक्लियस में शामिल हो जाता है। कई मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का अनुक्रमण जर्मलाइन में मौजूद उत्परिवर्तन (सम्मिलन और / या विलोपन (आईएनडीईएल)) के मिश्रण का प्रतिनिधित्व करेगा जो फेनोटाइप11 में योगदान देता है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल मातृ-प्रभाव जीन में CRISPR-Cas9 उत्परिवर्तन बनाने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करता है और मातृ क्रिस्पेंट दृष्टिकोण (चित्रा 1) का उपयोग करके संबंधित फेनोटाइप की पहचान करता है। खंड एक बताएगा कि आरएनए को प्रभावी ढंग से कैसे डिजाइन और बनाया जाए, जबकि खंड दो और तीन में सूक्ष्म इंजेक्शन द्वारा मातृ क्रिस्पेंट बनाने के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। CRISPR-Cas9 मिश्रण को इंजेक्ट करने के बाद, पीसीआर (अनुभाग चार) के माध्यम से दैहिक संपादन के लिए इंजेक्शन भ्रूण की जांच की जाती है। एक बार इंजेक्शन वाले एफ 0 भ्रूण विकसित हो जाते हैं और यौन परिपक्वता तक पहुंच जाते हैं, तो एफ 0 मादाओं को जंगली प्रकार के पुरुषों में पार किया जाता है, और उनकी संतानों को मातृ-प्रभाव फेनोटाइप (खंड पांच) के लिए जांच की जाती है। खंड छह में मातृ क्रिस्पेंट अगुणित बनाने के निर्देश शामिल हैं जिन्हें सीआरआईएसपीआर-सीएएस 9-प्रेरित आईएनडीईएल की पहचान करने के लिए सेंगर अनुक्रमण के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, चर्चा में संशोधन शामिल हैं जो इस विधि की संवेदनशीलता और शक्ति को बढ़ाने के लिए प्रोटोकॉल में किए जा सकते हैं।

determining the role of maternally-expressed genes in early development with maternal crispants

प्रारंभिक विकास ओजेनेसिस के दौरान परिपक्व अंडाणु में शामिल मातृ कारकों के एक पूल पर निर्भर करता है जो युग्मनज जीनोम सक्रियण तक विकास के लिए आवश्यक सभी सेलुलर कार्य करते हैं। आमतौर पर, इन मातृ कारकों के आनुवंशिक लक्ष्यीकरण के लिए मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान करने के लिए एक अतिरिक्त पीढ़ी की आवश्यकता होती है, जो विकास के दौरान मातृ-व्यक्त जीन की भूमिका निर्धारित करने की क्षमता में बाधा डालती है। CRISPR-Cas9 की द्वि-आयामी संपादन क्षमताओं की खोज ने इंजेक्शन वाले भ्रूण या "क्रिस्पेंट्स" के दैहिक ऊतकों में भ्रूण फेनोटाइप की स्क्रीनिंग की अनुमति दी है, जिससे विकास कार्यक्रमों में युग्मक-व्यक्त जीन की भूमिका की समझ बढ़ जाती है। यह आलेख एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो क्रिस्पेंट विधि का विस्तार है। इस विधि में, रोगाणु कोशिकाओं का द्विगुणी संपादन एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप के अलगाव की अनुमति देता है, या "मातृ क्रिस्पेंट्स" के लिए। मल्टीप्लेक्सिंग गाइड आरएनए को एक लक्ष्य के लिए मातृ क्रिस्पेंट के कुशल उत्पादन को बढ़ावा देता है, जबकि मातृ क्रिस्पेंट अगुणित का अनुक्रम विश्लेषण आनुवंशिक घावों की पुष्टि करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है जो मातृ-प्रभाव फेनोटाइप का उत्पादन करते हैं। मातृ क्रिस्पेंट का उपयोग आवश्यक मातृ-व्यक्त जीन की तेजी से पहचान का समर्थन करता है, इस प्रकार प्रारंभिक विकास की समझ को सुविधाजनक बनाता है।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रयोगात्मक दृष्टिकोण एक तेजी से, संसाधन-कुशल तरीके से मातृ प्रभाव फेनोटाइप की पहचान के लिए अनुमति देता है (चित्रा 1)।
मातृ कुरकुरापन पैदा करना: एकल...

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Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

प्रारंभिक विकास मातृ-विरासत वाले उत्पादों पर निर्भर है, और इनमें से कई उत्पादों की भूमिका वर्तमान में अज्ञात है। यहां, हमने एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है जो एक पीढ़ी में मातृ-प्रभाव फेनोटाइप की पहचान करने के लिए CRISPR-Cas9 का उपयोग करता है।

मातृ क्रिस्पेंट के साथ प्रारंभिक विकास में मातृ-व्यक्त जीन की भूमिका का निर्धारण

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Research

JoVE Journal

Genetics

The Use of Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

The Use of Induced Somatic Sector Analysis ISSA for Studying Genes and Promoters Involved in Wood Formation and Secondary Stem Development

जीन और प्रमोटरों लकड़ी संरचना और माध्यमिक स्टेम विकास में शामिल अध्ययन के लिए प्रेरित दैहिक क्षेत्र के विश्लेषण (आईएसएसए) का प्रयोग करें

Secondary stem growth in trees and associated wood formation are significant both from biological and commercial perspectives. However, relatively little ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

हेलिक्स विकृत, साइट-विशिष्ट डीएनए Interstrand crosslinks के प्रसंस्करण में वास्तु प्रोटीन HMGB1 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए उपकरण

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

माउस दिलों में overexpress को rAAV9 की तैयारी या पछाड़ना जीन

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

लक्षित<em&gt; बगल में</emनवोदित खमीर में&gt; mutagenesis Histone के जीन

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

वास्तविक समय प्रतिलेखन कारक बंधन, प्रतिलेखन, अनुवाद, और कारोबार सेलुलर सक्रियण के दौरान वैश्विक घटनाओं को प्रदर्शित करने के लिए विश्लेषण

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में Multicopy Plasmids की भूमिका का परीक्षण

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण

Complex diseases are often underpinned by multiple common genetic variants that contribute to disease susceptibility. Here, we describe a cost-effective ...

qKAT: Quantitative Semi-automated Typing of Killer-cell Immunoglobulin-like Receptor Genes

qkat: मात्रात्मक अर्द्ध-हत्यारा सेल immunoglobulin की तरह रिसेप्टर जीन की स्वचालित टाइपिंग

Killer cell immunoglobulin-like receptors (KIRs) are a set of inhibitory and activating immune receptors, on natural killer (NK) and T cells, encoded by a ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर बेमिसिया टैबची के अंडे निषेचन दर का निर्धारण

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...