Name: chicken recombinant limbs assay to understand morphogenesis, patterning, and early steps in cell differentiation
Uploaded: 2022-01-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation at JoVE.com

Мы благодарим Эстефанию Гарай-Пачеко за изображения на рисунке 2 и Марию Валерию Чимал-Монтес де Ока за художественные работы. Эта работа была поддержана Генеральным обществом ассоциаций личной академии (DGAPA)-Национальным автономным университетом Мексики [номера грантов IN211117 и IN213314] и Национальным советом по вопросам науки и техники (CONACyT) [грант No 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia], присужденный JC-M. JC M-L был получателем постдокторской стипендии от Национального совета науки и техники (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).

Это исследование было рассмотрено и одобрено Институциональным наблюдательным советом по уходу за лабораторными животными и их использованию Института биомедических исследований Национального автономного университета Мексики (УНАМ, Мехико, Мексика). Схематическая блок-схема общих ...

<ol>
	<li>Malashichev, Y., Christ, B., Pr&#246;ls, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+pelvis+originates+from+lateral+plate+mesoderm+and+its+development+requires+signals+from+both+ectoderm+and+paraxial+mesoderm.">Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm.</a> Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).</li><li>Mahmood, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+FGF-8+in+the+initiation+and+maintenance+of+vertebrate+limb+bud+outgrowth.">A role for FGF-8 in the initiation and maintenance of vertebrate limb bud outgrowth.</a> Current Biology. 5 (7), 797-806 (1995).</li><li>Yu, K., Ornitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+regulates+mesenchymal+differentiation+and+skeletal+patterning+along+the+limb+bud+proximodistal+axis.">FGF signaling regulates mesenchymal differentiation and skeletal patterning along the limb bud proximodistal axis.</a> Development. 135 (3), 483-491 (2008).</li><li>Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+mediates+the+polarizing+activity+of+the+ZPA.">Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA.</a> Cell. 75 (5), 1401-1416 (1993).</li><li>McQueen, C., Towers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+the+pattern+of+the+vertebrate+limb.">Establishing the pattern of the vertebrate limb.</a> Development. 147 (17), (2020).</li><li>Zwilling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+fragmented+and+of+dissociated+limb+bud+mesoderm.">Development of fragmented and of dissociated limb bud mesoderm.</a> Developmental biology. 9 (1), 20-37 (1964).</li><li>Frederick, J. M., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proportion+and+distribution+of+polarizing+zone+cells+causing+morphogenetic+inhibition+when+coaggregated+with+anterior+half+wing+mesoderm+in+recombinant+limbs.">The proportion and distribution of polarizing zone cells causing morphogenetic inhibition when coaggregated with anterior half wing mesoderm in recombinant limbs.</a> Development. 67 (1), 13-25 (1982).</li><li>Ros, M. A., Lyons, G. E., Mackem, S., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+limbs+as+a+model+to+study+homeobox+gene+regulation+during+limb+development.">Recombinant limbs as a model to study homeobox gene regulation during limb development.</a> Developmental Biology. 166 (1), 59-72 (1994).</li><li>Piedra, M. E., Rivero, F. B., Fernandez-Teran, M., Ros, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+formation+and+regulation+of+gene+expressions+in+chick+recombinant+limbs.">Pattern formation and regulation of gene expressions in chick recombinant limbs.</a> Mechanisms of Development. 90 (2), 167-179 (2000).</li><li>Crosby, G. M., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+effect+on+limb+morphogenesis+by+cells+of+the+polarizing+zone+coaggregated+with+pre-or+postaxial+wing+bud+mesoderm.">Inhibitory effect on limb morphogenesis by cells of the polarizing zone coaggregated with pre-or postaxial wing bud mesoderm.</a> Developmental Biology. 46 (1), 28-39 (1975).</li><li>Fallon, J. F., Simandl, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+chick+limb+bud+mesoderm+and+reptile+ectoderm+result+in+limb+outgrowth+in+the+limbless+mutant.">Interactions between chick limb bud mesoderm and reptile ectoderm result in limb outgrowth in the limbless mutant.</a> Anatomical Record. 208, 53-54 (1984).</li><li>Kuhlman, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limb+deformity+proteins:+role+in+mesodermal+induction+of+the+apical+ectodermal+ridge.">Limb deformity proteins: role in mesodermal induction of the apical ectodermal ridge.</a> Development. 124 (1), 133-139 (1997).</li><li>Goetinck, P. F., Abbott, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+limb+morphogenesis.+I.+Experiments+with+the+polydactylous+mutant,+talpid.">Studies on limb morphogenesis. I. Experiments with the polydactylous mutant, talpid.</a> Journal of Experimental Zoology. 155, 161-170 (1964).</li><li>Carrington, J. L., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+limb+budding+is+independent+of+apical+ectodermal+ridge+activity;+evidence+from+a+limbless+mutant.">Initial limb budding is independent of apical ectodermal ridge activity; evidence from a limbless mutant.</a> Development. 104 (3), 361-367 (1988).</li><li>Fernandez-Teran, M., Piedra, M. E., Ros, M. A., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recombinant+limb+as+a+model+for+the+study+of+limb+patterning,+and+its+application+to+muscle+development.">The recombinant limb as a model for the study of limb patterning, and its application to muscle development.</a> Cell and Tissue Research. 296 (1), 121-129 (1999).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Ganan, Y., Macias, D., Duterque-Coquillaud, M., Ros, M. A., Hurle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+TGF+beta+s+and+BMPs+as+signals+controlling+the+position+of+the+digits+and+the+areas+of+interdigital+cell+death+in+the+developing+chick+limb+autopod.">Role of TGF beta s and BMPs as signals controlling the position of the digits and the areas of interdigital cell death in the developing chick limb autopod.</a> Development. 122 (8), 2349-2357 (1996).</li><li>Ros, M. A., Simandl, B. K., Clark, A. W., Fallon, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+manipulating+the+chick+limb+bud+to+study+gene+expression,+tissue+interactions,+and+patterning.">Methods for manipulating the chick limb bud to study gene expression, tissue interactions, and patterning.</a> Developmental Biology Protocols. 137, 245-266 (2000).</li><li>MacCabe, J. A., Saunders, J. W., Pickett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+the+anteroposterior+and+dorsoventral+axes+in+embryonic+chick+limbs+constructed+of+dissociated+and+reaggregated+limb-bud+mesoderm.">The control of the anteroposterior and dorsoventral axes in embryonic chick limbs constructed of dissociated and reaggregated limb-bud mesoderm.</a> Developmental Biology. 31 (2), 323-335 (1973).</li><li>Zwilling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+contact+between+mutant+(wingless)+limb+buds+and+those+of+genetically+normal+chick+embryos:+confirmation+of+a+hypothesis.">Effects of contact between mutant (wingless) limb buds and those of genetically normal chick embryos: confirmation of a hypothesis.</a> Developmental Biology. 39 (1), 37-48 (1974).</li><li>Prahlad, K. V., Skala, G., Jones, D. G., Briles, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limbless:+A+new+genetic+mutant+in+the+chick.">Limbless: A new genetic mutant in the chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 209 (3), 427-434 (1979).</li><li>Marin Llera, J. C., Lorda-Diez, C. I., Hurle, J., Chimal-Monroy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCA-1/Ly6A+mesodermal+skeletal+progenitor+subpopulations+reveal+differential+commitment+of+early+limb+bud+cells.">SCA-1/Ly6A mesodermal skeletal progenitor subpopulations reveal differential commitment of early limb bud cells.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 656999 (2021).</li></ol>

В целом, протокол RL можно разделить на пять этапов: (1) инкубация эмбриона, (2) получение мезодермальных клеток конечностей для заполнения эктодерм, (3) получение эктодерм, (4) сборка мезодермальных клеток внутри эктодермальных покровов и (5) трансплантация заполненных эктодерм в эмбрионы х?...

Конечность позвоночных является грозной моделью для изучения дифференцировки клеток, пролиферации клеток, гибели клеток, формирования паттернов и морфогенеза 1,2. Во время развития конечности возникают в виде выпуклостей из клеток, полученных из боковой пластинки мезодермы1. Почки конечностей состоят из центрального ядра мезодермальных клеток, покрытых эктодермой. Из этой ранней структуры возникает цельная и хорошо сформированная конечность. После возникновения бутона конечности распознаются три оси: (1) проксимо-дистальная ось ([PD] плечо к пальцам), (2) дорсо-вентральная ось ([DV] от тыльной стороны руки до ладони) и (3) передне-задняя ([AP] большой палец к пальцу). Проксимально-дистальная ось зависит от апикального эктодермального гребня (АЭР), специализированной эктодермы, расположенной на дистальном кончике бутона конечности. AER необходим для роста, поддержания выживаемости, пролиферации и недифференцированного состояния клеток, получающих сигналы 2,3. С другой стороны, зона поляризационной активности (ZPA) контролирует переднезаднюю картину4, в то время как дорсальная и эктодерма контролируют дорсовентральный паттерн 7,8. Интеграция трехмерного паттерна подразумевает сложные перекрестные помехи между этими тремя осями5. Несмотря на понимание молекулярного пути во время развития конечностей, открытые вопросы о механизмах, которые контролируют паттерн и правильный рост для формирования целой конечности, остаются без ответа.
Эдгар Цвиллинг разработал систему рекомбинантных конечностей (RL) в 1964 году для изучения взаимодействия между мезенхимальными клетками конечностей и эктодермой в развивающихся конечностях6. Система RL собирает диссоциированную-реагрегированную мезодерму почки конечности в эктодерму эмбриональной конечности, чтобы пересадить ее в дорсальную часть донорского эмбриона цыпленка. Сигналы, обеспечиваемые эктодермой, индуцируют экспрессию генов дифференцировки и генов паттернов пространственно-временным образом, тем самым вызывая формирование конечностной структуры, которая может повторять клеточные программы, возникающие во время развития конечностей 7,8,9.
Модель RL ценна для понимания свойств компонентов конечностей и взаимодействия между мезодермальными и эктодермальными клетками6. RL можно определить как конечноподобную структуру, созданную экспериментально собирающими или рекомбинирующими мезодермальными клетками почек конечностей внутри эктодермального покрова6. Морфогенез RL зависит от характеристик мезодермальных клеток (или других типов), которые будут реагировать на сигналы эктодермального паттерна. Одним из преимуществ этой экспериментальной системы является ее универсальность. Эта характеристика позволяет создавать множественные комбинации путем изменения источника мезодермальных клеток, таких как клетки с разных стадий развития, из разных положений вдоль конечности, или целые (недиссоциированные) или реагрегированные клетки 7,8,9,10. Другим примером является возможность получения эмбриональной эктодермы от видов, отличных от кур, например, черепахи11, перепела или мыши12.
В этом смысле метод RL помогает изучать развитие конечностей и взаимодействия между мезенхимальными и эктодермальными клетками конечностей с эволюционной точки зрения. Этот метод также имеет большой потенциал для анализа способности различных источников клеток-предшественников дифференцироваться в конечностную структуру, используя сигналы, предоставляемые эмбриональной эктодермой 12,13,14. В отличие от культур in vitro, RL позволяет оценивать дифференцировку и морфогенетический потенциал клеточной популяции путем интерпретации эмбриональных сигналов от развивающейся конечности 9,15.
В этом протоколе приведено пошаговое руководство по выполнению успешной РЛ с реагрегированными клетками мезодермальных почек конечностей, что открывает возможность адаптации этого протокола с различными источниками реагрегированных клеток или даже различными источниками эктодермы.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Angled slit knife</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>2.75mm DB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11052-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>1704-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-HG</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>Incumatic de Mexico</td>
			<td>Incumatic 1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine surgical forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>9115-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipet</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palladium wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>7440 05-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Nest</td>
			<td>705001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pippette</td>
			<td>crmglobe</td>
			<td>PF1016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi DV4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tape</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin porcine</td>
			<td>Merck</td>
			<td>9002 07-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten needle</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>E74-15096/01</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chicken recombinant limbs assay to understand morphogenesis, patterning, and early steps in cell differentiation

Клеточная дифференцировка - это тонко настроенный процесс клеточной приверженности, приводящий к образованию различных специализированных типов клеток во время создания развивающихся тканей и органов. Этот процесс активно поддерживается в зрелом возрасте. Дифференцировка клеток – это непрерывный процесс во время развития и гомеостаза органов. Понимание ранних этапов дифференцировки клеток имеет важное значение для знания других сложных процессов, таких как морфогенез. Таким образом, рекомбинантные куриные конечности являются экспериментальной моделью, позволяющей изучать дифференцировку клеток и генерацию паттернов по сигналам эмбрионального паттерна. Эта экспериментальная модель имитирует среду in vivo ; он собирает реагрегированные клетки в эктодермальную оболочку, полученную из раннего бутона конечности. Позже эктодермы переносятся и имплантируются в рецептор эмбриона цыпленка, чтобы обеспечить его развитие. Этот анализ в основном использовался для оценки клеток мезодермальных почек конечностей; однако он может быть применен к другим стволовым клеткам или клеткам-предшественникам других организмов.

Распознавание хорошо выполненной рекомбинантной конечности После пересадки обработанные эмбрионы были возвращены в инкубатор, чтобы позволить RL развиваться. Время инкубации коррелировало с требованиями эксперимента. Тем не менее, RL можно легко отличить после 12 ч импланта?...

Watch this Scientific Journal Video about Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation at JoVE.com

Chicken Recombinant Limbs Assay to Understand Morphogenesis, Patterning, and Early Steps in Cell Differentiation

Рекомбинантные конечности являются мощной экспериментальной моделью, позволяющей изучать процесс дифференцировки клеток и генерации паттернов под влиянием эмбриональных сигналов. Этот протокол представляет собой подробный метод генерации рекомбинантных конечностей с куриными конечностями-мезодермальными клетками, адаптируемыми к другим типам клеток, полученных от разных организмов.

Анализ куриных рекомбинантных конечностей для понимания морфогенеза, паттернов и ранних этапов дифференцировки клеток

Cell differentiation is the fine-tuned process of cell commitment leading to the formation of different specialized cell types during the establishment of ...

Рекомбинантные конечности являются мощной моделью для исследования в процессе дифференцировки клеток и формирования мощности под воздействием эмбриональных сигналов в среде in vivo. Этот анализ допускает несколько вариаций, допускающих потенциальное применение, не ограничиваясь биологией развития куриных конечностей. Он может быть применен к другому стволу или прародителю от других организмов.Для начала извлеките яйца из инкубатора через три с половиной дня, смажьте 70% этанолом и оставьте их сушиться на воздухе. Затем определите и найдите развивающиеся эмбрионы, поцеловав яйцеклетку и наблюдая за кровеносными сосудами. Выбросьте яйца, у которых нет эмбриона.Постучите тупым концом яичной скорлупы концом пары тупых щипцов, чтобы открыть окно и удалить около одного квадратного сантиметра скорлупы с помощью щипцов. Затем переложите яйца в пластиковый или картонный держатель. Поместите яйца по одному под стереомикроскоп.Определите воздушную мембрану и удалите ее, выбрав небольшое отверстие в области без каких-либо сосудов. Вытащите эту область с помощью тонких хирургических щипцов и удалите кусочки яичной скорлупы, контактирующие с эмбрионом. Разорвать амниотический мешок тонкими хирургическими щипцами.Осторожно извлеките эмбрион из яйца тупыми щипцами и перенесите его в стерильную чашку Петри, содержащую ледяной 1x PBS. Вымойте эмбрионы один раз в ледяном 1x PBS и извлеките все оставшиеся мембраны под стереомикроскопом. Затем найдите почки задних конечностей.Срезайте каждую почку заднего скольжения продольно, разрезая очень близко к боку эмбриона тонкими хирургическими щипцами. Поддержание эмбрионов в 1x PBS. Затем переложите почки конечностей в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку с пластиковой переносной пипеткой.Далее замените PBS на 500 микролитров 0,5% раствора трипсина. Высиживайте почки конечностей в термоблоке в течение семи минут при температуре 37 градусов Цельсия. Затем замените раствор трипсина 500 микролитрами двух миллиграммов на миллилитр коллагеназы четвертого типа в HBSS и инкубируйте его в термоблоке еще восемь минут.Удалите как можно больше коллагеназы и замените ее одним миллилитром холодного высокоуглекового DMEM с 10% FBS для инактивации ферментов. Пипетку смесь аккуратно примерно 10 раз. Отфильтруйте суспензию, содержащую клетки, с помощью 70-микрометрового клеточного ситечка, чтобы оставить после себя эктодермы.Пипетку снова суспензию примерно в пять-10 раз и центрифугу по 200 раз по г в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем отбросьте супернатант. Вымойте избыток коллагеназы одним миллилитром среды, затем центрифугируйте суспензию и осторожно выбросьте среду.Далее добавляют 1,5 миллилитра среды, не нарушая клетки, и инкубируют их в течение одного до 1,5 часов при 37 градусах Цельсия в термоблоке, позволяя клеткам образовывать компактную гранулу. После получения бутонов задних конечностей переложите их в пустую микроцентрифужную трубку с пластиковой пипеткой. Удалите избыток 1x PBS и замените его 500 микролитрами 0,5% трипсина в стерильном 1x PBS.Инкубировать смесь в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия в термоблоке. Переложите раствор трипсина с почками конечностей в стерильную чашку Петри. Затем удалите как можно больше избытка трипсина и затопите чашку Петри ледяным 1x PBS с 10% FBS, пока все почки конечностей не будут покрыты.Определите почки конечностей под стереомикроскопом. Затем определите эктодерму как слегка отделенную прозрачную мембрану от мезодермальных клеток конечности. Отделите и отделите эктодерму щипцами, удерживающими самый проксимальный конец бутона конечности, тонкими хирургическими щипцами.Возьмите мезодермальную гранулу с предыдущих этапов и выбросьте около 600 микролитров среды. Затем аккуратно отсоедините гранулу наконечником пипетки, не разбивая ее. Переверните трубку вверх дном, чтобы перенести гранулу в чашку Петри, содержащую пустые эктодермы.Вырежьте небольшой кусочек гранулы парой тонких хирургических щипцов и поместите его как можно ближе к эктодерме. Откройте эктодерму хирургическими щипцами и поместите гранулу как можно плотнее в эктодермальный зал. Откройте амниотический мешок возле передней конечности, чтобы обнажить правый фланг эмбриона.Ориентируясь в положение передней конечности, выполняют раневую расчесывание вольфрамовой иглой на длину двух-трех сомитов, слегка повреждая мезодерму до тех пор, пока она не кровоточит. По отдельности перенесите рекомбинантные конечности в эмбрион цыпленка, поместив его основание над раной сомита. Правильно зафиксируйте рекомбинантную конечность двумя кусками палладиевой проволоки.Выровняйте основание рекомбинантной конечности с раной. Заклейте окно скотчем и верните яйцо в инкубатор. При успешной имплантации рекомбинантная конечность наблюдалась как выступ, который надежно прикреплялся к мезодермальной стенке донорского эмбриона.Напротив, рекомбинантная конечность была отделена от мезодермальной стенки или представляла грубую морфологию, когда либо жизнеспособность клетки, либо трансплантат не удались. Алциановое синее окрашивание продемонстрировало скелетные элементы в шестидневной куриной рекомбинантной конечности курицы. Перед очисткой алцианского синего цвета были получены изображения в этаноле для морфологических и количественных измерений.Окрашенные H & E или неокрашенные конечности были разрезаны для наблюдения за тканями и клетками. Этот метод может развивать органоиды конечностей in vivo и изучать дифференцировку клеток или морфогенетический процесс с использованием стволовых клеток из разных источников или видов.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Прививка шариков в развивающихся куриных эмбрионов Конечности выявлять пути передачи сигналов, влияющие экспрессии генов

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Стволовых клеток, как<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбриональные эксплантов для изучения раннего развития, особенности нейронных<em&gt; In Vitro</em&gt; И<em&gt; В Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells

Инициирование дифференциация в увековечена МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ ушные клетки-предшественники

Use of human induced pluripotent stem cells (iPSC) or embryonic stem cells (ESC) for cell replacement therapies holds great promise. Several limitations ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Убыт- и Gain-оф-функции подход к расследованию Early Cell Судьба определителям предимплантационной эмбрионов мыши

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Роман<em&gt; Ex Ово</em&gt; Кольцевание Техника Альтер внутрисердечной гемодинамики в системе Эмбриональные Chicken

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

В Ово Электропорация в курином слуховом мозге

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

В пробирке Выращивания яйцеклетку для Live клеточной Imaging зигота поляризации и кучность эмбриона в проростках Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Использование в естественных условиях и тканей и клеток экспланта подходы к изучению морфогенеза и патогенез эмбриональных и перинатальной аорты

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Переходное лечение стволовых клеток человека с DMSO для содействия дифференциации

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...