Name: culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

Vi anerkender den tekniske bistand fra Translational Research Institute Histology core og Biological Resource Facility. Denne forskning blev støttet af finansiering fra en Princess Alexandra Research Foundation-pris (I.V., E.D.W.) og Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Center for Personalized Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute modtager støtte fra den australske regering.

Patienterne har givet samtykke til denne undersøgelse efter deres indlæggelse under urologiteamet på Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen og inden for etiske og institutionelle retningslinjer (etisk nummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
BEMÆRK: Som kriterier for støtteberettigelse var patienterne i alderen ≥ 18 år med kræft og i stand til at forstå og give samtykke. De, der i...

<ol>
	<li>Saginala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+bladder+cancer.">Epidemiology of bladder cancer.</a> Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).</li><li>Lindskrog, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multi-omics+analysis+identifies+prognostic+molecular+subtypes+of+non-muscle-invasive+bladder+cancer.">An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer.</a> Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).</li><li>Isharwal, S., Konety, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+invasive+bladder+cancer+risk+stratification.">Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification.</a> Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).</li><li>Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genetic+urinary+biomarkers+for+surveillance+of+non-muscle+invasive+bladder+cancer:+a+systematic+review.">Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review.</a> BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).</li><li>Batista, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERT+promoter+mutation+as+a+potential+predictive+biomarker+in+bcg-treated+bladder+cancer+patients.">TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients.</a> Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).</li><li>Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+muscle-invasive+and+advanced+bladder+cancer+in+2020.">Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020.</a> Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).</li><li>Williams, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+costs+and+long-term+outcomes+of+patients+with+high-risk+non-muscle-invasive+bladder+cancer+treated+with+bacillus+calmette-gu&#233;rin+in+the+veterans+affairs+health+system.">Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-gu&#233;rin in the veterans affairs health system.</a> JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodr&#237;guez-Faba, O., Dom&#237;nguez-Escrig, J. L., Fern&#225;ndez-G&#243;mez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+treatments+for+BCG+failure+in+non-muscle+invasive+bladder+cancer+(NMIBC).">Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC).</a> Actas Urol&#243;gicas Espa&#241;olas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).</li><li>Berry, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+decision+making+in+patients+with+bladder+cancer.">Treatment decision making in patients with bladder cancer.</a> Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+experimental+human+tissue-derived+models+for+prostate+cancer+research.">Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research.</a> International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges,+applications+and+future+directions+of+precision+medicine+in+prostate+cancer+-+the+role+of+organoids+and+patient-derived+xenografts.">Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts.</a> British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).</li><li>Pan, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+bladder+cancer+patient-derived+xenografts+for+molecularly+guided+targeted+therapy.">Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy.</a> PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).</li><li>Gopinathan, A., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+GEM+models+for+experimental+cancer+therapeutics.">The use of GEM models for experimental cancer therapeutics.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).</li><li>Kemp, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chemical+carcinogenesis:+driving+breakthroughs+in+cancer+research+for+100+years.">Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming:+Modeling+urological+cancer+and+translation+to+clinics.">Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics.</a> Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Kim, I. H., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer.">Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer.</a> Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).</li><li>Raphael, M. J., Booth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+chemotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer:+Underused+across+the+49(th)+parallel.">Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel.</a> Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).</li><li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+patient-derived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+organoid+models.">Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Fusco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+(PDOs)+as+a+novel+in+vitro+model+for+neuroblastoma+tumours.">Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours.</a> BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+organoids+and+spheroids:+potential+tools+for+normal+and+diseased+tissue+modelling.">Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling.</a> Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49fhigh+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+model+of+urothelial+cancer:+establishment+and+applications+for+bladder+cancer+research.">Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research.</a> Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).</li></ol>

Mens 3D-organoidprotokoller afledt af blærekræftvæv stadig er i deres barndom, er de et område med aktiv forskning og klinisk undersøgelse. Her er en optimeret protokol til succesfuldt at etablere blærekræft PPO'er, der er egnede til både NMIBC- og MIBC-prøver, detaljeret. Denne arbejdsgang integreres parallelt i hospitalsbaserede kliniske forsøg og tager højde for periodisering af biobankprøver, herunder histologisk prøvebehandling og friskfrosset vævsbank, hvilket er en vigtig overvejelse for kliniske org...

Blærekræft er den mest udbredte urinvejskræft og den tiende mest almindelige menneskelige malignitet på verdensplan1. Det omfatter et genetisk forskelligartet og fænotypisk komplekst spektrum af sygdom2. Urothelial ikke-muskelinvasiv form for blærekræft (NMIBC) er de mest almindelige blærekræftdiagnoser (70% -80%), og disse kræftformer udviser betydelig biologisk heterogenitet og variable kliniske resultater 2,3,4. Patienter med NMIBC oplever typisk en høj risiko for tilbagefald af sygdommen (50-70 %), og en tredjedel af kræftformerne vil udvikle sig og udvikle sig til signifikant mere aggressiv muskelinvasiv blærekræft (MIBC)2. Selvom 5-års overlevelsesraten for NMIBC er høj (>90%), skal disse patienter gennemgå langsigtet klinisk behandling5. På den anden side betragtes lokalt avanceret (ikke-resekterbar) eller metastatisk MIBC generelt som uhelbredelig6. Derfor har blærekræft en af de højeste levetidsbehandlingsomkostninger inden for kræftbehandling og er en betydelig byrde for både den enkelte og sundhedssystemet 3,7. De underliggende genetiske afvigelser i fremskreden sygdom gør terapeutisk behandling af blærekræft til en klinisk udfordring, og terapeutiske muligheder for invasive urothelial tumorer er først for nylig forbedret siden godkendelsen af immunterapier til både avanceret og højrisiko NMIBC 8,9. I øjeblikket er klinisk beslutningstagning blevet styret af konventionelle kliniske og histopatologiske træk, på trods af individuelle blærekræfttumorer, der viser store forskelle i sygdomsaggressivitet og respons på terapi10. Der er et presserende behov for at fremskynde forskningen i klinisk nyttige modeller for at forbedre forudsigelsen af den enkelte patients prognose og identifikationen af effektive behandlinger.
Tredimensionelle (3D) organoider viser stort potentiale som tumormodeller på grund af deres evne til selvorganisering og rekapitulation af den oprindelige tumors iboende in vivo-arkitektur og farmakogenomiske profil og deres evne til at spejle den oprindelige cellulære funktionalitet i det oprindelige væv, hvorfra de blev afledt 11,12,13 . Selvom etablerede blærekræftcellelinjer er let tilgængelige, relativt omkostningseffektive, skalerbare og enkle at manipulere, undlader in vitro-cellelinjerne stort set ikke at efterligne spektret af forskellige genetiske og epigenetiske ændringer, der er observeret i klinisk blærekræft12,14 og blev alle etableret og vedligeholdt under 2D, klæbende kulturbetingelser. Derudover har cellelinjer afledt af primære og metastatiske blæretumorer betydelig genetisk divergens fra det oprindelige tumormateriale. 8,15.
En alternativ tilgang er at anvende gensplejsede og kræftfremkaldende musemodeller. Mens disse modeller rekapitulerer nogle af de naturlige onkogene kaskader, der er involveret i human neoplasi (gennemgået i refs 16,17,18), mangler de tumorheterogenitet, er dyre, repræsenterer dårligt invasiv og metastatisk blærekræft og er ikke levedygtige til hurtig lægemiddeltest, da tumorer kan tage mange måneder at udvikle 14,19 . Patientafledte modeller af kræft (herunder organoider, betinget omprogrammeret primærcellekultur og xenografts) giver uvurderlige muligheder for at forstå virkningerne af lægemiddelbehandling før klinisk behandling20. På trods af dette bruger få grupper rutinemæssigt disse patient-proksimale modeller på grund af begrænset adgang til frisk primær patientvæv og den omfattende optimering, der kræves for reproducerbart at generere patientafledte organoide (BOB) dyrkningsbetingelser. I en in vivo-indstilling kan onkogene celler interagere og kommunikere med forskellige sammensætninger af de omgivende bestanddele, herunder stromalceller, væv, der infiltrerer immunceller, og matrix12. Tilsvarende for PPO'er, der dyrkes i et 3D-format, kan cellulær / matrixkompleksitet tilpasses til at omfatte andre relevante komponenter. PPO'er kan genereres hurtigt og er ofte i stand til at blive passeret i vid udstrækning eller kryokonserveret til senere brug, på trods af at de har en begrænset levetidpå 21,22,23. Farmakodynamik (dvs. respons på et lægemiddel) kan evalueres ved hjælp af flere udlæsninger, herunder organoid levedygtighed og morfologi, og karakterisering af immunhistokemiske mål eller transkriptionelle ændringer.
Her beskrives procedurerne for etablering af blærekræftorganoider fra patientmateriale indsamlet fra transuretral resektion af blæretumor (TURBT) eller kirurgisk fjernelse af blæren (radikal cystektomi). Metoden til at generere PPO'er er illustreret ved hjælp af let tilgængelige våde laboratoriematerialer og -værktøjer. Slutpunkter omfatter ændringer i cellemorfologiske egenskaber og levedygtighed. Disse blev målt ved hjælp af fluorescensmikroskopi, in vitro-levedygtighed (metabolisk og cellemembranintegritet) assays og histopatologisk analyse. Figur 1 viser arbejdsgangen for etablering af PPO'er for human blærekræft fra klinisk materiale opnået under elektiv kirurgi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661-500EA</td>
			<td>polypropylene single-use tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase/ Hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (w/w) ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ultra low attachment plate (Black)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>BioScientific</td>
			<td>2939</td>
			<td>Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free recombinant EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>518179</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (TC20)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 additive</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Increases sphere-forming efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17105041</td>
			<td>To enzymatically disrupt Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry and wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esky</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farmdyne (Iodine 16g/L)</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (L-alanine-L-glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>All-purpose buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>RCH44-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-25</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-50</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane extract (BME)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>SIRT-1 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonTs2U inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MFA510BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (p20, p100, p1000) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>ant-pm2</td>
			<td>Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>support proliferation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tube mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1 conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>WNT signalling regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1077-25mg</td>
			<td>Selective p38 MAP kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>WBLDHDL03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels, #11 blade</td>
			<td>Medical and Surgical Requisites</td>
			<td>EU-211-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Waste Bags</td>
			<td>Medical Search</td>
			<td>SU09125X16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine specimen jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1049-10mg</td>
			<td>Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools

Nuværende in vitro-terapeutiske testplatforme mangler relevans for tumorpatofysiologi, der typisk anvender kræftcellelinjer etableret som todimensionelle (2D) kulturer på vævskulturplast. Der er et kritisk behov for mere repræsentative modeller af tumorkompleksitet, der præcist kan forudsige terapeutisk respons og følsomhed. Udviklingen af tredimensionel (3D) ex vivo-kultur af patientafledte organoider (PTO'er), der stammer fra frisk tumorvæv, har til formål at afhjælpe disse mangler. Organoidkulturer kan anvendes som tumorsurrogater parallelt med rutinemæssig klinisk styring for at informere terapeutiske beslutninger ved at identificere potentielle effektive interventioner og indikere terapier, der kan være forgæves. Her har denne procedure til formål at beskrive strategier og en detaljeret trin-for-trin protokol til etablering af blærekræft PPO'er fra frisk, levedygtigt klinisk væv. Vores veletablerede, optimerede protokoller er praktiske til at oprette 3D-kulturer til eksperimenter ved hjælp af begrænset og forskelligartet udgangsmateriale direkte fra patienter eller patientafledt xenograft (PDX) tumormateriale. Denne procedure kan også anvendes af de fleste laboratorier udstyret med standard vævskulturudstyr. De organoider, der genereres ved hjælp af denne protokol, kan bruges som ex vivo-surrogater til at forstå både de molekylære mekanismer, der understøtter urologisk kræftpatologi og til at evaluere behandlinger for at informere klinisk ledelse.

3D-organoider blev med succes etableret fra human blærekræftpatient TURBT og cystektomivæv. Kort fortalt fremhæver denne teknik en hurtig dannelse af 3D-multicellulære strukturer, der både er levedygtige og egnede til andre endepunktsanalyser såsom histologisk evaluering, molekylær karakterisering (ved immunohistokemi eller kvantitativ PCR i realtid) og lægemiddelscreening. Under proceduren (figur 1) kunne de forskellige eluater under vores filtreringsfaser (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

Patientafledte organoider (PDO'er) er et kraftfuldt værktøj i translationel kræftforskning, der afspejler både sygdommens genetiske og fænotypiske heterogenitet og respons på personlige kræftbehandlinger. Her er en konsolideret protokol til generering af humane primære blærekræft-PSO'er som forberedelse til evaluering af fænotypiske analyser og lægemiddelresponser detaljeret.

Kultur af blærekræftorganoider som præcisionsmedicinske værktøjer

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

Denne metode er signifikant, fordi patientafledte organoider giver et hurtigt og kraftfuldt værktøj til at studere urologiske kræftformer, da de ofte efterligner den genetiske og fænotypiske heterogenitet af denne multispektrum sygdom. Organoider kan isoleres fra en begrænset mængde patientbiopsimateriale og kan hurtigt udvides til downstream-analyse. De organoider, der genereres ved hjælp af denne protokol, kan bruges både som modeller til at hjælpe os med at forstå det cellulære og molekylære grundlag for urologiske kræftformer og som præcisionsmedicinske værktøjer, så vi kan forudsige, hvilke behandlinger og individuelle patienter kræft kan reagere på.Til at begynde med skal du indsamle en frisk makroskopisk levedygtig tumorprøve fra kirurgi og sikre, at prøven er nedsænket i transportmedium i et sterilt 50 ml konisk rør eller urinprøvebeholder under transit. Registrer prøvedetaljer, herunder vævsvægt, prøvebeskrivelse og detaljer vedrørende eventuelle blod- og urinprøver på patientprøvens behandlingsark. Udskift forsigtigt transportmediet med 10 ml basale medier og lad tumorvævet slå sig ned ved tyngdekraften.Brug derefter tang til at fjerne tumorvævet og placere det i en steril 90 millimeter petriskål. Vævets vægt registreres i gram eller milligram på det kliniske prøvebehandlingsark og dissektionsgitter. Brug derefter sterile tang i et engangsskalpelblad monteret på et skalpelhåndtag, fjern det ikke-kræftfremkaldende væv og makroskopisk synlige nekrotiske områder.Vask tumorstykkerne en eller to gange med kold DPBS, saml derefter og overfør dem til en ny steril 90 millimeter petriskål. Tag et fotografi, tegn et vævsdiagram, og planlæg vævsdissektionen på et klinisk behandlingsgitter. Til histopatologisk analyse placeres ca. 50 mg tumorvæv i en mærket engangsplastisk histologikassette.Nedsænk derefter histologikassetten i en beholder med 5X til 10X volumen på 10% neutral bufferet formalin og inkuber natten over. Den følgende dag skal formalinen udskiftes med 70% ethanol til opbevaring ved fire grader Celsius, indtil vævet kan behandles. Til molekylær analyse skal du snapfryse mindst et tumorstykke i en RNase, DNase fri 1,5 ml kryovial ved hjælp af flydende nitrogen og opbevare ved minus 80 grader Celsius.Derefter dispenseres fem milliliter organoidmedium i 90 millimeter petriskålen indeholdende de resterende tumorstykker og mekanisk hakker vævet så fint som muligt. ved hjælp af et sterilt skalpelblad nummer 10. Overfør det finthakkede væv til et 50 ml konisk rør og tilsæt fire milliliter organoid medium, en milliliter 10X kollagenase / hyaluronidase og 0,1 milligram pr. Milliliter DNase I for at undgå celleklumpning.Inkuber det hakkede tumorvæv i enzymopløsning i en til to timer på en orbital shaker eller rotator i en inkubator for at dissociere fragmenter i en cellesuspension og nedbryde kollagener. Stop derefter fordøjelsen ved at tilsætte dobbelt så meget basalmedium til prøven. Centrifugering af prøven, aspirat, og kassér supernatanten.For at lyse forurenende røde blodlegemer skal du derefter suspendere pelleten i fem milliliter ammoniumchloridkaliumbuffer og inkubere røret ved stuetemperatur i tre minutter, eller indtil den fuldstændige lysis af de røde blodlegemer ses. Tilsæt derefter 20 ml basalt medium i røret. Centrifuger igen og aspirere supernatanten.På dette trin skal du placere en 10 ml alikvote 2X og 1X organoid medium i et 37 grader Celsius vandbad for at varme. Filtrer prøven først gennem en forfugtet reversibel 100 mikron sil i et nyt 50 ml rør for at fjerne stort uopløseligt materiale. Filtrer derefter eluten gennem en forvåd reversibel 37 mikron sil for at indsamle enkeltceller i små klynger til enkeltcelle- og immuncelleisolering.Vend derefter 37 mikron silen og tilsæt 10 ml basale medier for at samle små og moderate klynger. Påd hvert af disse nye 50 ml rør med DPBS til 40 ml, centrifuger derefter suspensionen og kassér supernatanten. Derefter tilsættes 10 ml basalmedie til røret, der indeholder enkeltcellerne, og tæl cellerne ved hjælp af trypanblåt eksklusionsfarvestof i en automatiseret celletæller.Bestem cellenummeret og levedygtigheden af celler. Den resterende prøve centrifugeres og erstattes med cellefrysningsopløsning eller basalmedier indeholdende 10 % føtalt kvægserum 1 % penicillin og streptomycin og 10 % DMSO, hvorefter prøverne anbringes i 1,5 ml kryovialer, opbevares i en selvfrysende beholder og straks overføres beholderne til en fryser på minus 80 grader Celsius. Den næste dag overføres kryoirale stofferne til kryogen væske eller luftfaseopbevaring til langtidsopbevaring.Derefter suspenderes de indsamlede små og moderate klynger med 500 mikroliter forvarmet 2X organoidmedium. Derefter tilsættes BME til cellerne med iskold P-1000 sterile filterpipettespidser og blandes forsigtigt. Pipetter hurtigt og forsigtigt 100 mikroliter af de rekonstituerede celler BME-blandingen til brønde med en ultralav fastgørelse, fladbundet 96-brønds plade, og læg pladen i en inkubator i 20 til 30 minutter for at størkne.Efter inkubation tilsættes organoidmedium oven på BME-cellesuspensionen i et forhold på et til to afhængigt af det empirisk vurderede volumen, og pladen anbringes i en inkubator i 20 minutter for at udligne. Efter inkubation skal du fjerne pladen fra inkubatoren og samle den på en prøveholder på scenen i et mikroskop for at vurdere organoider visuelt under fasekontrast eller lyse feltindstillinger. Fyld mediet op hver anden til tredje dag ved hjælp af 50 mikroliter forvarmet organoidmedium for at genopbygge udtømte vækstfaktorer og det samlede volumen.Hent timelapse-seriebillederne på dag 1, 2 og 3 samt 5, 7 og 10, før du passerer. To timers fordøjelse af blærekræftvæv med kommercielt tilgængeligt kollagenase/ hyaluronidase og DNase I fører til tilstrækkelig fordøjelse af 0,5 til 1 kubikmillimeter stykker mere komplekst cystektomibiopsivæv, herunder de neoplastiske celler i lamina propria og muskulære lag af blæren. Større fragmenter efter fordøjelsen er velegnede til dyrkning og standard vævskulturplader af enhver størrelse for at isolere nye todimensionelle kulturer.Organoider genereret ved denne procedure gennemgår dynamisk selvmontering, herunder faser af aggregering, komprimering og endelig dannelse af stramme cellulære strukturer. Histologisk rekapitulerer disse strukturer den oprindelige patienttumor. Organoider genereret i denne procedure er egnede til mange formål, herunder yderligere histopatologisk karakterisering, biobanking og lægemiddeleffektivitetstest.Efter generering af organoider kan yderligere metoder anvendes til at profilere disse tumorer, herunder rollen som kræftbehandling, metabolisk profilering eller transkriptionsprofilering. Inden for denne 3D-ramme giver disse yderligere metoder kraftig indsigt i blærekræftbiologi. Denne metode var et vigtigt grundlag for undersøgelser, der undersøgte immunoonkologi og cellulær metabolisme.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Muse ortotopisk Blære Tumor Model og Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3D-celle kultur System for at studere Invasion og evaluere Therapeutics i blærekræft

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Magnetic Resonance Imaging vurdering af kræftfremkaldende-inducerede Murine blære tumorer

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som værktøjer til at oversætte genotyper og Mutational profiler til farmakologiske reaktioner

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, Manipulation, og ortotoptransplantation af mus blære Tumor organoider

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ortotopisk transplantation af brysttumorer som prækliniske modeller for brystkræft

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellering af oral-esophageal pladecellekarcinom i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering og kultur af patientafledte brystorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Etablering og karakterisering af patientafledte xenograftmodeller af anaplastisk thyreoideakarcinom og pladecellekarcinom i hoved og hals

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Author Spotlight: Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids 

Udvikling og optimering af en human hepatocellulært carcinom patientafledt organoidmodel til potentiel målidentifikation og lægemiddelopdagelse

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...