Name: culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

Wir danken der technischen Unterstützung des Translational Research Institute Histology Core und der Biological Resource Facility. Diese Forschung wurde durch Mittel aus einem Preis der Princess Alexandra Research Foundation (I.V., E.D.W.) und dem Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Das Translational Research Institute wird von der australischen Regierung unterstützt.

Die Patienten haben dieser Studie zugestimmt, nachdem sie im Rahmen des Urologie-Teams am Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien, aufgenommen wurden. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki und innerhalb ethischer und institutioneller Richtlinien (Ethiknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165) durchgeführt.
HINWEIS: Als Zulassungskriterien waren die Patienten im Alter von ≥ 18 Jahren mit Krebs und in der Lage, zu verstehen und ihre Zu...

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	<li>Saginala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+bladder+cancer.">Epidemiology of bladder cancer.</a> Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).</li><li>Lindskrog, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Kim, I. H., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer.">Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer.</a> Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).</li><li>Raphael, M. J., Booth, C. 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Während 3D-Organoidprotokolle, die aus Blasenkrebsgewebe gewonnen werden, noch in den Kinderschuhen stecken, sind sie ein Bereich der aktiven Forschung und klinischen Untersuchung. Hier wird ein optimiertes Protokoll zur erfolgreichen Etablierung von Blasenkrebs-PDOs beschrieben, die sowohl für NMIBC- als auch für MIBC-Proben geeignet sind. Dieser Workflow integriert sich parallel in klinische Studien im Krankenhaus und berücksichtigt die Rückstellung von Biobankproben, einschließlich der histologischen Probenverar...

Blasenkrebs ist der am weitesten verbreitete Harnwegskrebs und der zehnthäufigste menschliche Malignitätskarzinom weltweit1. Es umfasst ein genetisch vielfältiges und phänotypisch komplexes Krankheitsspektrum2. Urotheliale nicht-muskel-invasive Formen von Blasenkrebs (NMIBC) sind die häufigsten Blasenkrebsdiagnosen (70%-80%), und diese Krebsarten weisen eine beträchtliche biologische Heterogenität und variable klinische Ergebnisseauf 2,3,4. Patienten mit NMIBC haben typischerweise ein hohes Risiko für ein Wiederauftreten der Krankheit (50-70%) und ein Drittel der Krebserkrankungen wird fortschreiten und sich zu signifikant aggressiverem muskelinvasivem Blasenkrebs (MIBC) entwickeln2. Obwohl die 5-Jahres-Überlebensraten für NMIBC hoch sind (>90%), müssen sich diese Patienten einem langfristigen klinischen Managementunterziehen 5. Auf der anderen Seite wird lokal fortgeschrittene (insektierbare) oder metastasierende MIBC im Allgemeinen als unheilbarangesehen 6. Folglich hat Blasenkrebs eine der höchsten lebenslangen Behandlungskosten in der Krebsbehandlung und ist eine erhebliche Belastung sowohl für den Einzelnen als auch für das Gesundheitssystem 3,7. Die zugrunde liegenden genetischen Aberrationen bei fortgeschrittenen Erkrankungen machen die therapeutische Behandlung von Blasenkrebs zu einer klinischen Herausforderung, und die therapeutischen Optionen für invasive Urotheltumoren haben sich erst kürzlich seit der Zulassung von Immuntherapien für fortgeschrittene und Hochrisiko-NMIBC 8,9 verbessert. Derzeit wird die klinische Entscheidungsfindung von konventionellen klinischen und histopathologischen Merkmalen geleitet, obwohl einzelne Blasenkrebstumoren große Unterschiede in der Krankheitsaggressivität und dem Ansprechen auf die Therapiezeigen 10. Es ist dringend notwendig, die Erforschung klinisch nützlicher Modelle zu beschleunigen, um die Vorhersage der individuellen Patientenprognose und die Identifizierung wirksamer Behandlungen zu verbessern.
Dreidimensionale (3D) Organoide zeigen ein großes Potenzial als Tumormodelle aufgrund ihrer Fähigkeit, die intrinsische In-vivo-Architektur und das pharmakogenomische Profil des ursprünglichen Tumors selbst zu organisieren und zu rekapitulieren, und ihrer Fähigkeit, die native zelluläre Funktionalität des ursprünglichen Gewebes, aus dem sie abgeleitet wurden, zu spiegeln11,12,13 . Obwohl etablierte Blasenkrebs-Zelllinien leicht verfügbar, relativ kostengünstig, skalierbar und einfach zu manipulieren sind, können die In-vitro-Zelllinien das Spektrum verschiedener genetischer und epigenetischer Veränderungen, die bei klinischen Blasenkrebserkrankungen beobachtet wurden, weitgehend nicht nachahmen12,14 und wurden alle unter 2D-, adhärenten Kulturbedingungen etabliert und aufrechterhalten. Darüber hinaus weisen Zelllinien, die von primären und metastasierten Blasentumoren stammen, eine signifikante genetische Divergenz vom ursprünglichen Tumormaterial auf. 8,15
Ein alternativer Ansatz ist die Verwendung gentechnisch veränderter und karzinogeninduzierter Mausmodelle. Während diese Modelle jedoch einige der natürlichen onkogenen Kaskaden rekapitulieren, die an der menschlichen Neoplasie beteiligt sind (überprüft in Refs 16, 17, 18), fehlt es ihnen an Tumorheterogenität, sie sind teuer, stellen invasiven und metastasierenden Blasenkrebs schlecht dar und sind nicht für schnelle Medikamententests geeignet, da die Entwicklung von Tumoren viele Monate dauern kann 14,19 . Von Patienten abgeleitete Krebsmodelle (einschließlich Organoide, bedingt umprogrammierte primäre Zellkultur und Xenotransplantate) bieten unschätzbare Möglichkeiten, die Auswirkungen der medikamentösen Behandlung vor der klinischen Behandlungzu verstehen 20. Trotzdem verwenden nur wenige Gruppen routinemäßig diese patientenproximalen Modelle, da der Zugang zu frischem primärem Patientengewebe begrenzt ist und eine umfassende Optimierung erforderlich ist, um reproduzierbare Bedingungen für die Kultur von Patienten abgeleitete Organoide (PDO) zu erzeugen. In einer In-vivo-Umgebung können onkogene Zellen mit verschiedenen Zusammensetzungen der umgebenden Bestandteile interagieren und kommunizieren, einschließlich Stromazellen, gewebeinfiltrierende Immunzellen und Matrix12. In ähnlicher Weise kann bei PDOs, die in einem 3D-Format gezüchtet werden, die Zell-/Matrixkomplexität angepasst werden, um andere relevante Komponenten einzubeziehen. PDOs können schnell erzeugt werden und können oft extensiv durchgelassen oder für die spätere Verwendung kryokonserviert werden, obwohl sie eine begrenzte Lebensdauervon 21,22,23 haben. Die Pharmakodynamik (d. h. das Ansprechen auf ein Arzneimittel) kann anhand mehrerer Auslesungen bewertet werden, einschließlich der Organoidlebensfähigkeit und -morphologie sowie der Charakterisierung von immunhistochemischen Zielen oder transkriptionellen Veränderungen.
Hier werden die Verfahren zur Etablierung von Blasenkrebs-Organoiden aus Patientenmaterial beschrieben, das bei der transurethralen Resektion von Blasentumoren (TURBT) oder der chirurgischen Entfernung der Blase (radikale Zystektomie) gesammelt wurde. Die Methode zur Generierung von g.U. wird unter Verwendung leicht verfügbarer nasser Labormaterialien und -werkzeuge veranschaulicht. Endpunkte sind Veränderungen der morphologischen Eigenschaften und der Lebensfähigkeit der Zellen. Diese wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie, In-vitro-Lebensfähigkeit (metabolische und Zellmembranintegrität) und histopathologische Analyse gemessen. Abbildung 1 zeigt den Workflow zur Etablierung menschlicher Blasenkrebs-PDOs aus klinischem Material, das während einer elektiven Operation erhalten wurde.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661-500EA</td>
			<td>polypropylene single-use tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase/ Hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (w/w) ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ultra low attachment plate (Black)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>BioScientific</td>
			<td>2939</td>
			<td>Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free recombinant EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>518179</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (TC20)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 additive</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Increases sphere-forming efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17105041</td>
			<td>To enzymatically disrupt Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry and wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esky</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farmdyne (Iodine 16g/L)</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (L-alanine-L-glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>All-purpose buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>RCH44-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-25</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-50</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane extract (BME)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>SIRT-1 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonTs2U inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MFA510BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (p20, p100, p1000) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>ant-pm2</td>
			<td>Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>support proliferation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tube mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1 conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>WNT signalling regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1077-25mg</td>
			<td>Selective p38 MAP kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>WBLDHDL03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels, #11 blade</td>
			<td>Medical and Surgical Requisites</td>
			<td>EU-211-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Waste Bags</td>
			<td>Medical Search</td>
			<td>SU09125X16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine specimen jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1049-10mg</td>
			<td>Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools

Aktuelle therapeutische In-vitro-Testplattformen haben keine Relevanz für die Tumorpathophysiologie, da sie typischerweise Krebszelllinien verwenden, die als zweidimensionale (2D) Kulturen auf Gewebekulturplastik etabliert sind. Es besteht ein kritischer Bedarf an repräsentativeren Modellen der Tumorkomplexität, die das therapeutische Ansprechen und die Sensitivität genau vorhersagen können. Die Entwicklung einer dreidimensionalen (3D) Ex-vivo-Kultur von patientenabgeleiteten Organoiden (PDOs), die aus frischem Tumorgewebe gewonnen werden, zielt darauf ab, diese Mängel zu beheben. Organoidkulturen können parallel zum routinemäßigen klinischen Management als Tumorsurrogate verwendet werden, um therapeutische Entscheidungen zu treffen, indem potenziell wirksame Interventionen identifiziert und Therapien angezeigt werden, die möglicherweise nutzlos sind. Hier zielt dieses Verfahren darauf ab, Strategien und ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zu beschreiben, um Blasenkrebs-PDOs aus frischem, lebensfähigem klinischem Gewebe zu etablieren. Unsere gut etablierten, optimierten Protokolle sind praktisch, um 3D-Kulturen für Experimente mit begrenztem und vielfältigem Ausgangsmaterial direkt aus Patienten oder patientenabgeleitetem Xenotransplantat-Tumormaterial (PDX) einzurichten. Dieses Verfahren kann auch von den meisten Labors angewendet werden, die mit Standard-Gewebekulturgeräten ausgestattet sind. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können als Ex-vivo-Surrogate verwendet werden, um sowohl die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der urologischen Krebspathologie zugrunde liegen, als auch Behandlungen zu bewerten, um das klinische Management zu informieren.

3D-Organoide wurden erfolgreich aus humanem Blasenkrebspatienten TURBT und Zystektomiegewebe nachgewiesen. Kurz gesagt, diese Technik hebt eine schnelle Bildung von 3D-multizellulären Strukturen hervor, die sowohl lebensfähig als auch für andere Endpunktanalysen wie histologische Bewertung, molekulare Charakterisierung (durch Immunhistochemie oder quantitative Echtzeit-PCR) und Wirkstoffscreening geeignet sind. Während des Verfahrens (Abbildung 1) konnten die verschiedenen Eluate während unserer Filtrationsphasen (<...

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Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

Patientenabgeleitete Organoide (PDOs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug in der translationalen Krebsforschung, das sowohl die genetische als auch die phänotypische Heterogenität der Krankheit und das Ansprechen auf personalisierte Krebstherapien widerspiegelt. Hier wird ein konsolidiertes Protokoll zur Erzeugung von PDOs für primären Blasenkrebs beim Menschen in Vorbereitung auf die Bewertung von phänotypischen Analysen und Arzneimittelreaktionen detailliert beschrieben.

Kultur von Blasenkrebs-Organoiden als Werkzeuge der Präzisionsmedizin

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

Diese Methode ist von Bedeutung, da von Patienten abgeleitete Organoide ein schnelles und leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung urologischer Krebserkrankungen darstellen, da sie häufig die genetische und phänotypische Heterogenität dieser Multispektrum-Krankheit nachahmen. Organoide können aus einer begrenzten Menge an Patientenbiopsiematerial isoliert und für die nachgelagerte Analyse schnell erweitert werden. Die mit diesem Protokoll erzeugten Organoide können sowohl als Modelle verwendet werden, um die zellulären und molekularen Grundlagen urologischer Krebserkrankungen zu verstehen, als auch als präzisionsmedizinische Werkzeuge, mit denen wir vorhersagen können, auf welche Behandlungen und einzelnen Patienten Krebs ansprechen könnte.Sammeln Sie zunächst eine frische makroskopisch lebensfähige Tumorprobe aus der Operation und stellen Sie sicher, dass die Probe während des Transports in ein steriles 50-Milliliter-Konusröhrchen oder Urinprobenglas in ein Transportmedium eingetaucht wird. Notieren Sie Probendetails, einschließlich Gewebegewicht, Probenbeschreibung und Details zu Blut- und Urinproben auf dem Verarbeitungsblatt für Patientenproben. Ersetzen Sie das Transportmedium vorsichtig durch 10 Milliliter Basalmedien und lassen Sie das Tumorgewebe durch Schwerkraft absetzen.Als nächstes entfernen Sie mit einer Pinzette das Tumorgewebe und legen es in eine sterile 90-Millimeter-Petrischale. Notieren Sie das Gewicht des Gewebes in Gramm oder Milligramm auf dem klinischen Probenverarbeitungsblatt und dem Seziergitter. Entfernen Sie dann mit einer sterilen Pinzette in einer Einweg-Skalpellklinge, die an einem Skalpellgriff montiert ist, das nicht krebsartige Gewebe und die makroskopisch sichtbaren nekrotischen Regionen.Waschen Sie die Tumorstücke ein- bis zweimal mit kaltem DPBS, sammeln Sie sie dann und geben Sie sie in eine neue sterile 90-Millimeter-Petrischale. Machen Sie ein Foto, zeichnen Sie ein Gewebediagramm und planen Sie die Gewebedissektion auf einem klinischen Verarbeitungsgitter. Für die histopathologische Analyse legen Sie etwa 50 Milligramm des Tumorgewebes in eine markierte Einweg-Plastikhistologiekassette.Tauchen Sie dann die Histologiekassette in einen Behälter mit 5X bis 10X Volumen von 10% neutralem gepuffertem Formalin und inkubieren Sie über Nacht. Ersetzen Sie am folgenden Tag das Formalin durch 70% Ethanol für die Lagerung bei vier Grad Celsius, bis das Gewebe verarbeitet werden kann. Für die molekulare Analyse mindestens ein Tumorstück in einer RNase, DNase-freiem 1,5-Milliliter-Kryo mit flüssigem Stickstoff einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern.Als nächstes geben Sie fünf Milliliter Organoidmedium in die 90-Millimeter-Petrischale mit den restlichen Tumorstücken ab und zerkleinern das Gewebe mechanisch so fein wie möglich. mit einer sterilen Skalpellklinge Nummer 10. Übertragen Sie das fein gehackte Gewebe in eine 50-Milliliter-konische Röhre und fügen Sie vier Milliliter Organoidmedium, einen Milliliter 10-fache Kollagenase / Hyaluronidase und 0,1 Milligramm pro Milliliter DNase I hinzu, um Zellverklumpungen zu vermeiden.Inkubieren Sie das zerkleinerte Tumorgewebe in Enzymlösung für ein bis zwei Stunden auf einem Orbitalshaker oder Rotator in einem Inkubator, um Fragmente in eine Zellsuspension zu dissoziieren und Kollagene abzubauen. Stoppen Sie dann den Aufschluss, indem Sie der Probe das doppelte Volumen an basalem Medium hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Probe, saugen Sie den Überstand ab und verwerfen Sie ihn.Als nächstes, um kontaminierende rote Blutkörperchen zu lysieren, suspendieren Sie das Pellet in fünf Milliliter Ammoniumchlorid-Kaliumpuffer und inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur für drei Minuten oder bis die vollständige Lyse der roten Blutkörperchen gesehen wird. Dann 20 Milliliter Basalmedium in die Tube geben. Zentrifugieren Sie erneut und saugen Sie den Überstand ab.Legen Sie bei diesem Schritt ein 10 Milliliter Aliquot aus 2X und 1X Organoidmedium in ein 37 Grad Celsius warmes Wasserbad. Filtern Sie die Probe zuerst durch ein vornasses reversibles 100-Mikron-Sieb in ein neues 50-Milliliter-Rohr, um großes unlösliches Material zu entfernen. Filtern Sie dann die Elute durch ein vornasses reversibles 37-Mikron-Sieb, um einzelne Zellen in kleinen Clustern für die Einzelzell- und Immunzellisolierung zu sammeln.Als nächstes kehren Sie das 37-Mikron-Sieb um und fügen Sie 10 Milliliter Basalmedien hinzu, um kleine und mittelgroße Cluster zu sammeln. Füllen Sie jedes dieser neuen 50-Milliliter-Röhrchen mit DPBS auf 40 Milliliter auf, zentrifugieren Sie dann die Suspension und entsorgen Sie den Überstand. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter Basalmedien zu dem Röhrchen hinzu, das die einzelnen Zellen enthält, und zählen Sie die Zellen mit Trypanblau-Ausschlussfarbstoff in einem automatisierten Zellzähler.Bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit von Zellen. Zentrifugieren Sie die restliche Probe und ersetzen Sie das Medium durch Zellgefrierlösung oder Basalmedien, die 10% fetales Rinderserum 1% Penicillin und Streptomycin und 10% DMSO enthalten, dann legen Sie die Proben in 1,5 Milliliter Kryofrüchte, lagern Sie sie in einem selbstgefrierenden Behälter und geben Sie die Behälter sofort in einen Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius. Am nächsten Tag werden die Kryogene zur Langzeitlagerung in eine kryogene Flüssigkeits- oder Luftphasenlagerung überführt.Als nächstes resuspendieren Sie die gesammelten kleinen und mittelgroßen Cluster mit 500 Mikrolitern vorerwärmtem 2X-Organoidmedium. Dann mit eiskalten P-1000 sterilen Filterpipettenspitzen BME in die Zellen geben und vorsichtig mischen. Pipettieren Sie schnell und vorsichtig 100 Mikroliter der rekonstituierten BME-Mischung der Zellen in Vertiefungen mit extrem niedriger Befestigung, flacher 96-Well-Platte und legen Sie die Platte für 20 bis 30 Minuten in einen Inkubator, um sie zu verfestigen.Nach der Inkubation fügen Sie Organoidmedium auf die BME-Zellsuspension in einem Verhältnis von eins zu zwei hinzu, abhängig vom empirisch bewerteten Volumen, und legen Sie die Platte für 20 Minuten in einen Inkubator, um sich auszugleichen. Entfernen Sie nach der Inkubation die Platte aus dem Inkubator und montieren Sie sie auf einem Probenhalter auf dem Tisch eines Mikroskops, um Organoide visuell unter Phasenkontrast- oder Hellfeldeinstellungen zu beurteilen. Füllen Sie das Medium alle zwei bis drei Tage mit 50 Mikrolitern vorerwärmtem Organoidmedium auf, um erschöpfte Wachstumsfaktoren und das Gesamtvolumen wieder aufzufüllen.Erfassen Sie die Bilder der Zeitrafferserie an den Tagen 1, 2 und 3 sowie 5, 7 und 10, bevor Sie vergehen. Die zweistündige Verdauung von Blasenkrebsgewebe mit kommerziell erhältlicher Kollagenase/Hyaluronidase und DNase I führt zu einer ausreichenden Verdauung von 0,5 bis 1 Kubikmillimeter Stück komplexerer Zystektomiebiopsiegewebe, einschließlich der neoplastischen Zellen in der Lamina propria und den Muskelschichten der Blase. Größere Post-Digestion-Fragmente eignen sich für Kultur- und Standard-Gewebekulturplatten beliebiger Größe, um neuartige zweidimensionale Kulturen zu isolieren.Organoide, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, durchlaufen eine dynamische Selbstorganisation, einschließlich Phasen der Aggregation, Verdichtung und endgültigen Bildung enger zellulärer Strukturen. Histologisch rekapitulieren diese Strukturen den ursprünglichen Patiententumor. Organoide, die in diesem Verfahren erzeugt werden, eignen sich für viele Zwecke, einschließlich weiterer histopathologischer Charakterisierung, Biobanking und Arzneimittelwirksamkeitstests.Nach der Generierung von Organoiden können zusätzliche Methoden verwendet werden, um diese Tumoren zu profilieren, einschließlich der Rolle von Krebstherapien, metabolischem Profiling oder Transkriptionsprofiling. Innerhalb dieses 3D-Rahmens bieten diese zusätzlichen Methoden einen starken Einblick in die Biologie von Blasenkrebs. Diese Methode war eine wichtige Grundlage für Studien, die die Immunonkologie und den Zellstoffwechsel untersuchten.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Forschung

Krebsforschung

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Magnet-Resonanz-Tomographie Bewertung der murinen Blase Karzinogen-induzierte Tumoren

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostataorganoidkulturen als Werkzeuge zur Übersetzung von Genotypen und Mutationsprofilen in pharmakologische Reaktionen

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, Manipulation und orthotopische Transplantation von Mausblase Tumororganoiden

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablierung und Kultivierung von patienteneigenen Brustorganoiden

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Etablierung und Charakterisierung von patientenabgeleiteten Xenotransplantatmodellen des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms und des Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinoms

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Optimierung der Bildung von HCC-Organoiden für die Identifizierung von Zielmolekülen und die Entwicklung von Medikamenten

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der Pathogenese von Leberkrebs anhand von patienteneigenen Organoiden 

Entwicklung und Optimierung eines humanen hepatozellulären Karzinom-Patienten-abgeleiteten Organoidmodells zur Identifizierung potenzieller Zielmoleküle und zur Wirkstoffforschung

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...