Name: culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

우리는 Translational Research Institute Histology 핵심 및 Biological Resource Facility의 기술 지원을 인정합니다. 이 연구는 알렉산드라 공주 연구 재단 상 (I.V., E.D.W.)과 의학 연구 미래 기금 (MRFF) 신속한 응용 연구 번역 프로그램 (암 맞춤형 분석 센터 (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute는 호주 정부의 지원을 받습니다.

환자들은 호주 브리즈번에있는 프린세스 알렉산드라 병원 (Princess Alexandra Hospital)의 비뇨기과 팀에 입원 한 후이 연구에 동의했습니다. 이 연구는 헬싱키 선언의 원칙과 윤리적 및 제도적 지침 (윤리 번호 HREC / 05 / QPAH / 95, QUT 1000001165)에 따라 수행되었습니다.
참고 : 자격 기준으로, 환자는 암에 걸린 18 세 이≥었으며 동의를 이해하고 제공 할 수있었습니다. 정보에 입각 한 동?...

<ol>
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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Kim, I. H., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer.">Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer.</a> Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).</li><li>Raphael, M. J., Booth, C. 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(155), e60364 (2020).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Fusco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+(PDOs)+as+a+novel+in+vitro+model+for+neuroblastoma+tumours.">Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours.</a> BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+organoids+and+spheroids:+potential+tools+for+normal+and+diseased+tissue+modelling.">Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling.</a> Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49fhigh+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+model+of+urothelial+cancer:+establishment+and+applications+for+bladder+cancer+research.">Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research.</a> Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).</li></ol>

방광암 조직에서 파생 된 3D 오가노이드 프로토콜은 아직 초기 단계에 있지만 활발한 연구 및 임상 조사 영역입니다. 여기서, NMIBC 및 MIBC 표본 모두에 적합한 방광암 PDO를 성공적으로 확립하기 위한 최적화된 프로토콜이 상세히 설명된다. 이 워크플로우는 병원 기반 임상 시험에 병행하여 통합되며 조직학적 샘플 처리 및 임상 오가노이드 파이프라인의 중요한 고려 사항인 신선한 냉동 조직 뱅킹?...

방광암은 가장 널리 퍼진 요로 암이며 전 세계적으로 10 번째로 흔한 인간 악성 종양입니다1. 그것은 유전적으로 다양하고 표현형적으로 복잡한 스펙트럼의 질병2를 포괄한다. Urothelial non-muscle-invasive form of bladder cancer (NMIBC)는 방광암 진단 (70 % -80 %)의 가장 흔한 방광암 진단이며, 이러한 암은 상당한 생물학적 이질성 및 가변 임상 결과 2,3,4를 나타냅니다. NMIBC 환자는 일반적으로 질병 재발 위험이 높으며 (50-70 %), 암의 삼분의 일은 진행되어 훨씬 더 공격적인 근육 침습성 방광암 (MIBC)2로 발전합니다. NMIBC에 대한 5년 생존율은 높지만(>90%), 이들 환자는 장기적인 임상 관리를 받아야 한다5. 한편, 국부적으로 진행된(unresectable) 또는 전이성 MIBC는 일반적으로 난치성6으로 간주된다. 결과적으로, 방광암은 암 치료 내에서 가장 높은 평생 치료 비용 중 하나를 가지며 개인 및 건강 관리 시스템 3,7 모두에게 상당한 부담입니다. 진행성 질환의 근본적인 유전 적 수차는 방광암의 치료 관리를 임상 적 도전으로 만들고, 침습성 비뇨 생식기 종양에 대한 치료 옵션은 진행성 및 고위험 NMIBC 8,9에 대한 면역 요법의 승인 이후 최근에야 개선되었습니다. 현재, 임상 의사 결정은 개별 방광암 종양이 질병 공격성 및 요법10에 대한 반응에서 큰 차이를 보임에도 불구하고 종래의 임상 및 조직병리학적 특징에 의해 유도되었다. 개별 환자의 예후 예측과 효과적인 치료법의 식별을 개선하기 위해 임상적으로 유용한 모델에 대한 연구를 가속화해야 할 긴급한 필요성이 있습니다.
3차원 (3D) 오가노이드는 원래 종양의 내재적 생체 내 구조 및 약물 게놈 프로파일을 스스로 조직하고 재구성하는 능력과 이들이 유래 된 원래 조직의 고유 한 세포 기능을 반영하는 능력으로 인해 종양 모델로서 큰 잠재력을 보여줍니다11,12,13 . 확립된 방광암 세포주는 쉽게 이용가능하고, 비교적 비용 효율적이고, 확장 가능하고, 조작하기 간단하지만, 시험관내 세포주는 임상 방광암(12,14)에서 관찰된 다양한 유전적 및 후성유전학적 변화의 스펙트럼을 모방하는 데 크게 실패하고, 모두 2D, 부착성 배양 조건 하에서 확립되고 유지되었다. 추가적으로, 원발성 및 전이성 방광 종양으로부터 유래된 세포주는 원래의 종양 물질로부터 유의한 유전적 발산을 보유한다. 8,15년.
대안적인 접근법은 유전자 조작 및 발암물질 유발 마우스 모델을 사용하는 것이다. 그러나 이러한 모델은 인간 신생물에 관여하는 자연 종양성 캐스케이드 중 일부를 재검토하지만 (refs 16,17,18에서 검토), 종양 이질성이 부족하고 비용이 많이 들며 침습성 및 전이성 방광암을 제대로 나타내지 않으며 종양이 발병하는 데 수개월이 걸릴 수 있으므로 신속한 약물 검사에는 불가능합니다14,19 . 환자 유래 암 모델(오가노이드, 조건부로 재프로그램된 일차 세포 배양물, 및 이종이식편 포함)은 임상 치료20 전에 약물 치료의 효과를 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공한다. 그럼에도 불구하고, 신선한 일차 환자 조직에 대한 제한된 접근과 환자 유래 오가노이드 (PDO) 배양 조건을 재현 가능하게 생성하는 데 필요한 광범위한 최적화로 인해 이러한 환자 근위 모델을 일상적으로 사용하는 그룹은 거의 없습니다. 생체내 환경에서, 발암성 세포는 기질 세포, 조직 침윤 면역 세포, 및 매트릭스(12)를 포함하는 주변 구성성분의 다양한 조성물과 상호작용하고 통신할 수 있다. 마찬가지로, 3D 포맷으로 성장한 PDO의 경우, 셀룰러/매트릭스 복잡성은 다른 관련 컴포넌트를 포함하도록 커스터마이즈될 수 있다. PDO는 신속하게 생성될 수 있고, 종종 유한한 수명(21,22,23)을 가짐에도 불구하고, 광범위하게 계대되거나 나중에 사용하기 위해 동결보존될 수 있다. 약력학(즉, 약물에 대한 반응)은 오가노이드 생존력 및 형태학, 면역조직화학 표적의 특성화 또는 전사 변화를 포함하는 다중 판독을 사용하여 평가될 수 있다.
여기에서, 방광 종양의 경요도 절제술 (TURBT) 또는 방광의 외과적 제거 (라디칼 방광 절제술)로부터 수집 된 환자 물질로부터 방광암 오가노이드를 확립하는 절차가 기술되어 있다. PDO를 생성하는 방법은 쉽게 구할 수있는 습식 실험실 재료 및 도구를 사용하여 설명됩니다. 종점은 세포 형태학적 특성 및 생존력의 변화를 포함한다. 이들은 형광 현미경, 시험관내 생존력 (대사 및 세포막 완전성) 분석, 및 조직병리학적 분석을 사용하여 측정되었다. 도 1은 선택 수술 동안 수득된 임상 물질로부터 인간 방광암 PDO를 확립하기 위한 워크플로우를 보여준다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661-500EA</td>
			<td>polypropylene single-use tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase/ Hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (w/w) ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ultra low attachment plate (Black)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>BioScientific</td>
			<td>2939</td>
			<td>Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free recombinant EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>518179</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (TC20)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 additive</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Increases sphere-forming efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17105041</td>
			<td>To enzymatically disrupt Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry and wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esky</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farmdyne (Iodine 16g/L)</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (L-alanine-L-glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>All-purpose buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>RCH44-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-25</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-50</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane extract (BME)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>SIRT-1 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonTs2U inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MFA510BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (p20, p100, p1000) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>ant-pm2</td>
			<td>Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>support proliferation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tube mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1 conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>WNT signalling regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1077-25mg</td>
			<td>Selective p38 MAP kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>WBLDHDL03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels, #11 blade</td>
			<td>Medical and Surgical Requisites</td>
			<td>EU-211-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Waste Bags</td>
			<td>Medical Search</td>
			<td>SU09125X16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine specimen jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1049-10mg</td>
			<td>Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools

현재의 시험관내 치료 시험 플랫폼은 종양 병태생리학과의 관련성이 결여되어 있으며, 일반적으로 조직 배양 플라스틱 상에서 2차원(2D) 배양물로서 확립된 암 세포주를 채용하고 있다. 치료 반응과 민감도를 정확하게 예측할 수 있는 종양 복잡성에 대한 보다 대표적인 모델에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 신선한 종양 조직으로부터 유래된 환자 유래 오가노이드(PDOs)의 3차원(3D) 생체외 배양의 개발은 이러한 단점을 해결하는 것을 목표로 한다. 오가노이드 배양은 일상적인 임상 관리와 병행하여 종양 대리자로 사용되어 잠재적 인 효과적인 개입을 확인하고 쓸모없는 치료법을 나타냄으로써 치료 결정을 알릴 수 있습니다. 여기에서이 절차는 신선하고 실행 가능한 임상 조직에서 방광암 PDO를 확립하기위한 전략과 상세한 단계별 프로토콜을 설명하는 것을 목표로합니다. 우리의 잘 정립되고 최적화된 프로토콜은 환자 또는 환자 유래 이종이식편(PDX) 종양 물질로부터 직접 제한적이고 다양한 출발 물질을 사용하여 실험을 위한 3D 배양물을 설정하는 데 실용적입니다. 이 절차는 표준 조직 배양 장비를 갖춘 대부분의 실험실에서도 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 오가노이드는 비뇨기과 암 병리학을 뒷받침하는 분자 메커니즘을 이해하고 임상 관리를 알리기위한 치료법을 평가하기 위해 생체외 대리자로 사용할 수 있습니다.

3D 오가노이드는 인간 방광암 환자 TURBT 및 방광절제술 조직으로부터 성공적으로 확립되었다. 간단히 말해서,이 기술은 조직 학적 평가, 분자 특성화 (면역 조직 화학 또는 정량적 실시간 PCR에 의한) 및 약물 스크리닝과 같은 다른 종점 분석에 실행 가능하고 적합한 3D 다세포 구조의 신속한 형성을 강조합니다. 절차 (그림 1) 동안, 여과 단계 (그림 1, 단계 1-6<...

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Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

환자 유래 오가노이드 (PDO)는 질병의 유전 적 및 표현형 이질성과 개인화 된 항암 요법에 대한 반응을 모두 반영하는 번역 암 연구의 강력한 도구입니다. 여기서, 표현형 분석 및 약물 반응의 평가를 위한 준비로 인간 원발성 방광암 PDOs를 생성하기 위한 통합 프로토콜이 상세히 설명된다.

정밀 의학 도구로서의 방광암 오가노이드의 문화

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

이 방법은 환자 유래 오가노이드가이 다중 스펙트럼 질환의 유전 적 및 표현형 이질성을 자주 모방하기 때문에 비뇨기과 암을 연구하는 신속하고 강력한 도구를 제공하기 때문에 중요합니다. 오가노이드는 제한된 양의 환자 생검 물질로부터 분리될 수 있고 하류 분석을 위해 신속하게 확장될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 생성 된 오가노이드는 비뇨기과 암의 세포 및 분자 기초를 이해하는 데 도움이되는 모델과 암이 반응 할 수있는 치료법과 개별 환자를 예측할 수있는 정밀 의학 도구로 사용될 수 있습니다.시작하려면 수술에서 신선한 거시경 생존 가능한 종양 표본을 수집하고 시료가 운송 중에 멸균 된 50 밀리리터 원뿔형 튜브 또는 소변 표본 항아리의 수송 매체에 잠겨 있는지 확인하십시오. 조직 무게, 샘플 설명 및 환자 표본 처리 시트의 혈액 및 소변 샘플에 관한 세부 정보를 포함한 표본 세부 정보를 기록하십시오. 조심스럽게 수송 배지를 10 밀리리터의 기본 배지로 교체하고 종양 조직이 중력에 의해 침전되도록하십시오.다음으로, 포셉을 사용하여 종양 조직을 제거하고 멸균 된 90 밀리미터 페트리 접시에 넣으십시오. 조직의 무게를 임상 표본 처리 시트 및 해부 격자에 그램 또는 밀리그램으로 기록하십시오. 그런 다음 메스 핸들에 장착 된 일회용 메스 블레이드에 멸균 포셉을 사용하여 비 암 조직과 거시적으로 보이는 괴사 부위를 제거하십시오.차가운 DPBS로 종양 조각을 한두 번 씻은 다음 수집하여 새로운 멸균 90mm 페트리 접시로 옮깁니다. 사진을 찍고, 조직도를 그리고, 임상 처리 그리드에서 조직 해부를 계획하십시오. 조직병리학적 분석을 위해, 종양 조직의 약 50 밀리그램을 라벨이 붙은 일회용 플라스틱 조직학 카세트에 넣는다.그런 다음 조직학 카세트를 10% 중성 완충 포르말린의 5X 내지 10X 부피의 용기에 담그고 밤새 인큐베이션한다. 다음날 포르말린을 70 % 에탄올로 교체하여 조직이 처리 될 때까지 섭씨 네 도에서 보관하십시오. 분자 분석을 위해, 액체 질소를 사용하여 RNase, DNase 프리 1.5 밀리리터 냉동 온도에서 적어도 하나의 종양 조각을 스냅 동결시키고 영하 80 °C에서 저장하십시오.다음으로, 나머지 종양 조각이 들어있는 90 밀리미터 페트리 접시에 다섯 밀리리터의 오가노이드 배지를 분배하고 가능한 한 미세하게 조직을 기계적으로 다듬는다. 멸균 번호 10 메스 블레이드를 사용합니다. 잘게 다진 조직을 50 밀리리터 원뿔형 튜브로 옮기고 세포 응집을 피하기 위해 4 밀리리터의 오가노이드 배지, 10X 콜라게나제 / 히알루로니다아제 1 밀리리터 및 밀리리터 DNase I 당 0.1 밀리그램을 첨가하십시오.다진 종양 조직을 효소 용액에서 한두 시간 동안 인큐베이터의 오비탈 진탕기 또는 회전기 상에서 인큐베이션하여 단편을 세포 현탁액으로 해리시키고 콜라겐을 분해한다. 그런 다음 기본 배지의 두 배 부피를 샘플에 추가하여 소화를 중단하십시오. 샘플을 원심분리하고, 흡인하고, 상청액을 버린다.다음으로, 오염된 적혈구를 용해시키기 위해, 펠렛을 오밀리리터의 염화암모늄칼륨 완충액에 재현탁시키고, 실온에서 삼분 동안 또는 적혈구의 완전한 용해가 보일 때까지 튜브를 인큐베이션한다. 그런 다음 튜브에 20 밀리리터의 기본 배지를 넣으십시오. 다시 원심분리하고 상청액을 흡인한다.이 단계에서 2X 및 1X 오가노이드 배지의 10 밀리리터 분취량을 섭씨 37도 수조에 넣어 따뜻하게하십시오. 샘플을 먼저 미리 습윤된 가역 100미크론 스트레이너를 통해 새로운 50밀리리터 튜브로 여과하여 큰 불용성 물질을 제거합니다. 그런 다음 미리 습윤된 가역적 37 미크론 스트레이너를 통해 용출액을 여과하여 단일 세포 및 면역 세포 분리를 위해 작은 클러스터에서 단일 세포를 수집합니다.그런 다음 37 미크론 스트레이너를 뒤집고 10 밀리리터의 기본 배지를 추가하여 작고 중간 크기의 클러스터를 수집하십시오. DPBS로 이 새로운 50밀리리터 튜브를 각각 40밀리리터까지 충전한 다음, 현탁액을 원심분리하고 상청액을 버립니다. 다음으로, 단일 세포가 들어있는 튜브에 10 밀리리터의 기본 배지를 추가하고 자동화 된 세포 카운터에서 트리판 블루 배제 염료를 사용하여 세포를 계산하십시오.세포의 세포 수와 생존력을 결정하십시오. 나머지 샘플을 원심분리하고 배지를 10% 태아 소 혈청 1%페니실린과 스트렙토마이신 및 10%DMSO를 함유하는 세포 동결 용액 또는 기저 배지로 교체한 다음, 샘플을 1.5밀리리터 냉동 용기에 넣고 자체 냉동 용기에 보관한 다음 즉시 용기를 영하 80도 냉동고로 옮깁니다. 다음 날, 극저온을 극저온 액체 또는 공기 상 저장소로 옮겨 장기간 보관하십시오.다음으로, 수집된 소형 및 중간 크기의 클러스터를 500 마이크로리터의 미리 예열된 2X 오가노이드 배지로 재현탁시킨다. 그런 다음 얼음처럼 차가운 P-1000 멸균 필터 피펫 팁으로 BME를 세포에 넣고 부드럽게 섞으십시오. 재구성된 BME 혼합물 100 마이크로리터를 초저 부착, 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 웰에 신속하고 조심스럽게 피펫하고, 플레이트를 20 내지 30분 동안 인큐베이터에 위치시켜 응고시킨다.인큐베이션 후 경험적으로 평가된 부피에 따라 하나 내지 두 개의 비율로 BME 세포 현탁액의 상부에 오가노이드 배지를 첨가하고, 플레이트를 20분 동안 인큐베이터에 배치하여 평형화시킨다. 인큐베이션 후, 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 현미경 스테이지의 시편 홀더에 조립하여 위상 대비 또는 밝은 필드 설정에서 오가노이드를 시각적으로 평가합니다. 고갈 된 성장 인자와 전체 부피를 보충하기 위해 미리 예열 된 오가노이드 배지 50 마이크로 리터를 사용하여 이틀에서 삼일마다 배지를 보충하십시오.통과 전에 1, 2, 3, 5, 7 및 10일에 타임랩스 시리즈 이미지를 가져옵니다. 시판되는 콜라게나제/히알루로니다아제 및 DNase를 사용한 방광암 조직의 2시간 소화는 라미나 프로프리아제 내의 신생물성 세포와 방광의 근육층을 포함한 보다 복잡한 방광절제술 생검 조직의 0.5~1입방밀리미터 조각의 충분한 소화를 유도한다. 더 큰 소화 후 단편은 신규한 이차원 배양물을 단리하기 위해 임의의 크기의 배양 및 표준 조직 배양 플레이트에 적합하다.이 절차에 의해 생성 된 오가노이드는 응집, 압축 및 단단한 세포 구조의 최종 형성을 포함하여 동적 자기 조립을 겪습니다. 조직학적으로, 이러한 구조는 원래의 환자 종양을 회수합니다. 이 절차에서 생성 된 오가노이드는 추가 조직 병리학 적 특성화, 바이오 뱅킹 및 약물 효능 테스트를 포함한 많은 목적에 적합합니다.오가노이드의 생성 후, 항암 요법, 대사 프로파일링 또는 전사 프로파일링의 역할을 포함하여 이들 종양을 프로파일링하기 위해 추가적인 방법이 사용될 수 있다. 이 3D 프레임 워크 내에서 이러한 추가 방법론은 방광암 생물학에 대한 강력한 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 면역 종양학 및 세포 신진 대사를 조사하는 연구의 중요한 토대였습니다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

쥐 동소 이식 방광 종양 모델 및 종양 탐지 시스템

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

연구

암 연구학

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

침공을 공부 하 고 방광 암에서 치료제를 평가 하기 위한 3 차원 셀 문화 시스템

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

발암 물질 유발 Murine 방광 종양의 자기 공명 영상 평가

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

약리학적 반응에 유전형과 돌연변이 단면도를 번역하는 공구로 전립선 오르가노이드 문화

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

마우스 방광 종양 오르가노이드의 문화, 조작 및 정형 외과 이식

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

유방암을 위한 전임상 모형으로 유방 종양의 정형소 이식

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

환자 유래 유방 오가노이드의 확립 및 배양

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Optimizing HCC Organoid Formation for Target Identification and Drug Development

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Author Spotlight: Investigating Liver Cancer Pathogenesis Using Patient-Derived Organoids 

잠재적 표적 식별 및 약물 발견을 위한 인간 간세포 암종 환자 유래 오가노이드 모델의 개발 및 최적화

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...