Name: culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

Vi erkänner det tekniska biståndet från Translational Research Institute Histology core och Biological Resource Facility. Denna forskning stöddes av finansiering från ett Princess Alexandra Research Foundation-pris (I.V., E.D.W.) och Medical Research Future Fund (MRFF) Rapid Applied Research Translation Program (Centre for Personalised Analysis of Cancers (CPAC; E.D.W., I.V.). Translational Research Institute får stöd från den australiensiska regeringen.

Patienter har samtyckt till denna studie efter deras inläggning under urologiteamet vid Princess Alexandra Hospital, Brisbane, Australien. Studien utfördes i enlighet med principerna i Helsingforsdeklarationen och inom ramen för etiska och institutionella riktlinjer (etiknummer HREC/05/QPAH/95, QUT 1000001165).
OBS: Som behörighetskriterier var patienterna ≥ 18 år med cancer och kunde förstå och ge samtycke. De som inte kunde ge informerat samtycke uteslöts. De som hade ett annat pri...

<ol>
	<li>Saginala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+bladder+cancer.">Epidemiology of bladder cancer.</a> Medical Sciences. 8 (1), 15 (2020).</li><li>Lindskrog, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+multi-omics+analysis+identifies+prognostic+molecular+subtypes+of+non-muscle-invasive+bladder+cancer.">An integrated multi-omics analysis identifies prognostic molecular subtypes of non-muscle-invasive bladder cancer.</a> Nature Communications. 12 (1), 2301 (2021).</li><li>Isharwal, S., Konety, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-muscle+invasive+bladder+cancer+risk+stratification.">Non-muscle invasive bladder cancer risk stratification.</a> Indian Journal of Urology. 31 (4), 289-296 (2015).</li><li>Lozano, F., Raventos, C. X., Carrion, A., Trilla, E., Morote, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+genetic+urinary+biomarkers+for+surveillance+of+non-muscle+invasive+bladder+cancer:+a+systematic+review.">Current status of genetic urinary biomarkers for surveillance of non-muscle invasive bladder cancer: a systematic review.</a> BMC Urology. 20 (1), 99 (2020).</li><li>Batista, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TERT+promoter+mutation+as+a+potential+predictive+biomarker+in+bcg-treated+bladder+cancer+patients.">TERT promoter mutation as a potential predictive biomarker in bcg-treated bladder cancer patients.</a> Internation Journal of Molecular Science. 21 (3), 947 (2020).</li><li>Patel, V. G., Oh, W. K., Galsky, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+of+muscle-invasive+and+advanced+bladder+cancer+in+2020.">Treatment of muscle-invasive and advanced bladder cancer in 2020.</a> Cancer Journal for Clinicians. 70 (5), 404-423 (2020).</li><li>Williams, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimated+costs+and+long-term+outcomes+of+patients+with+high-risk+non-muscle-invasive+bladder+cancer+treated+with+bacillus+calmette-gu&#233;rin+in+the+veterans+affairs+health+system.">Estimated costs and long-term outcomes of patients with high-risk non-muscle-invasive bladder cancer treated with bacillus calmette-gu&#233;rin in the veterans affairs health system.</a> JAMA Network Open. 4 (3), 213800 (2021).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+for+bladder+cancer+research.">Preclinical models for bladder cancer research.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 35 (3), 613-632 (2021).</li><li>lvarez-Maestro, M., Guerrero-Ramos, F., Rodr&#237;guez-Faba, O., Dom&#237;nguez-Escrig, J. L., Fern&#225;ndez-G&#243;mez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+treatments+for+BCG+failure+in+non-muscle+invasive+bladder+cancer+(NMIBC).">Current treatments for BCG failure in non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC).</a> Actas Urol&#243;gicas Espa&#241;olas (English Edition). 45 (2), 93-102 (2021).</li><li>Berry, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+decision+making+in+patients+with+bladder+cancer.">Treatment decision making in patients with bladder cancer.</a> Bladder Cancer. 1 (2), 151-158 (2015).</li><li>Drost, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+culture+systems+for+prostate+epithelial+and+cancer+tissue.">Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue.</a> Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).</li><li>Kato, M., Sasaki, T., Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+experimental+human+tissue-derived+models+for+prostate+cancer+research.">Current experimental human tissue-derived models for prostate cancer research.</a> International Journal of Urology. 28 (2), 150-162 (2021).</li><li>Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoid+(PDO)+platforms+to+facilitate+clinical+decision+making.">Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making.</a> Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).</li><li>Joshi, A., Roberts, M. J., Alinezhad, S., Williams, E. D., Vela, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges,+applications+and+future+directions+of+precision+medicine+in+prostate+cancer+-+the+role+of+organoids+and+patient-derived+xenografts.">Challenges, applications and future directions of precision medicine in prostate cancer - the role of organoids and patient-derived xenografts.</a> British Journal of Urology International. 126 (1), 65-72 (2020).</li><li>Pan, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+bladder+cancer+patient-derived+xenografts+for+molecularly+guided+targeted+therapy.">Development and characterization of bladder cancer patient-derived xenografts for molecularly guided targeted therapy.</a> PLoS One. 10 (8), 0134346 (2015).</li><li>Gopinathan, A., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+GEM+models+for+experimental+cancer+therapeutics.">The use of GEM models for experimental cancer therapeutics.</a> Disease models &amp; mechanisms. 1 (2-3), 83-86 (2008).</li><li>Kemp, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+chemical+carcinogenesis:+driving+breakthroughs+in+cancer+research+for+100+years.">Animal models of chemical carcinogenesis: driving breakthroughs in cancer research for 100 years.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (10), 865-874 (2015).</li><li>Day, C. P., Merlino, G., Van Dyke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+mouse+cancer+models:+a+maze+of+opportunities+and+challenges.">Preclinical mouse cancer models: a maze of opportunities and challenges.</a> Cell. 163 (1), 39-53 (2015).</li><li>Kobayashi, T., Owczarek, T. B., McKiernan, J. M., Abate-Shen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+bladder+cancer+in+mice:+opportunities+and+challenges.">Modelling bladder cancer in mice: opportunities and challenges.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 42-54 (2015).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+reprogramming:+Modeling+urological+cancer+and+translation+to+clinics.">Conditional reprogramming: Modeling urological cancer and translation to clinics.</a> Clinical Translational Medicine. 10 (2), 95 (2020).</li><li>Yoshida, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+patient-derived+tumor+xenograft+models+and+tumor+organoids.">Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids.</a> Journal of Hematological Oncology. 13 (1), 4 (2020).</li><li>Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+organoids:+model+systems+for+human+biology+and+medicine.">Human organoids: model systems for human biology and medicine.</a> Nature Reviews Molecular Cellular Biology. 21 (10), 571-584 (2020).</li><li>Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+xenograft+vs.+organoids:+a+preliminary+analysis+of+cancer+research+output,+funding+and+human+health+impact+in+2014-2019.">Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019.</a> Animals. 10 (10), 1923 (2020).</li><li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer.">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li><li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer.">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li><li>Kim, I. H., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perioperative+immunotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer.">Perioperative immunotherapy for muscle-invasive bladder cancer.</a> Translational Andrology and Urology. 9 (6), 2976-2985 (2020).</li><li>Raphael, M. J., Booth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoadjuvant+chemotherapy+for+muscle-invasive+bladder+cancer:+Underused+across+the+49(th)+parallel.">Neoadjuvant chemotherapy for muscle-invasive bladder cancer: Underused across the 49(th) parallel.</a> Canadian Urological Association Journal. 13 (2), 29-31 (2019).</li><li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+patient-derived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+organoid+models.">Isolation and characterization of patient-derived pancreatic ductal adenocarcinoma organoid models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), e60364 (2020).</li><li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells.">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).</li><li>Fusco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-derived+organoids+(PDOs)+as+a+novel+in+vitro+model+for+neuroblastoma+tumours.">Patient-derived organoids (PDOs) as a novel in vitro model for neuroblastoma tumours.</a> BMC Cancer. 19 (1), 970 (2019).</li><li>Mullenders, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+and+human+urothelial+cancer+organoids:+A+tool+for+bladder+cancer+research.">Mouse and human urothelial cancer organoids: A tool for bladder cancer research.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (10), 4567-4574 (2019).</li><li>Vasyutinv, I., Zerihun, L., Ivan, C., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+organoids+and+spheroids:+potential+tools+for+normal+and+diseased+tissue+modelling.">Bladder organoids and spheroids: potential tools for normal and diseased tissue modelling.</a> Anticancer Research. 39 (3), 1105-1118 (2019).</li><li>Santos, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Urothelial+organoids+originating+from+Cd49fhigh+mouse+stem+cells+display+Notch-dependent+differentiation+capacity.">Urothelial organoids originating from Cd49fhigh mouse stem cells display Notch-dependent differentiation capacity.</a> Nature Communications. 10 (1), 4407 (2019).</li><li>Whyard, T., Liu, J., Darras, F. S., Waltzer, W. C., Romanov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+model+of+urothelial+cancer:+establishment+and+applications+for+bladder+cancer+research.">Organoid model of urothelial cancer: establishment and applications for bladder cancer research.</a> Biotechniques. 69 (3), 193-199 (2020).</li></ol>

Medan 3D-organoidprotokoll som härrör från blåscancervävnad fortfarande är i sin linda, är de ett område för aktiv forskning och klinisk undersökning. Här beskrivs ett optimerat protokoll för att framgångsrikt etablera PDOs för blåscancer som är lämpliga för både NMIBC- och MIBC-prover. Detta arbetsflöde integreras parallellt i sjukhusbaserade kliniska prövningar och överväger periodisering av biobanksprov, inklusive histologisk provbehandling och färskfryst vävnadsbankning, vilket är ett viktig...

Blåscancer är den vanligaste urinvägscancern och den tionde vanligaste mänskliga maligniteten i världen1. Det omfattar ett genetiskt varierat och fenotypiskt komplext spektrum av sjukdom2. Uroteliala icke-muskelinvasiva former av blåscancer (NMIBC) är de vanligaste blåscancerdiagnoserna (70% -80%), och dessa cancerformer uppvisar betydande biologisk heterogenitet och varierande kliniska resultat 2,3,4. Patienter med NMIBC upplever vanligtvis en hög risk för sjukdomsåterfall (50-70%) och en tredjedel av cancerformerna kommer att utvecklas och utvecklas till betydligt mer aggressiv muskelinvasiv blåscancer (MIBC)2. Även om 5-årsöverlevnaden för NMIBC är hög (>90%), måste dessa patienter genomgå långsiktig klinisk hantering5. Å andra sidan anses lokalt avancerad (oåterkallelig) eller metastatisk MIBC i allmänhet vara obotlig6. Följaktligen har blåscancer en av de högsta livstidsbehandlingskostnaderna inom cancervården och är en betydande börda för både individen och sjukvården 3,7. De underliggande genetiska avvikelserna i avancerad sjukdom gör terapeutisk hantering av blåscancer till en klinisk utmaning, och terapeutiska alternativ för invasiva uroteliala tumörer har först nyligen förbättrats sedan godkännandet av immunterapier för både avancerad och högrisk NMIBC 8,9. För närvarande har kliniskt beslutsfattande styrts av konventionella kliniska och histopatologiska egenskaper, trots att enskilda blåscancertumörer visar stora skillnader i sjukdomsaggressivitet och svar på terapi10. Det finns ett akut behov av att påskynda forskningen om kliniskt användbara modeller för att förbättra förutsägelsen av individuell patientprognos och identifiering av effektiva behandlingar.
Tredimensionella (3D) organoider visar stor potential som tumörmodeller på grund av deras förmåga att självorganisera och rekapitulera den ursprungliga tumörens inneboende in vivo-arkitektur och farmakogenomiska profil och deras förmåga att spegla den ursprungliga cellulära funktionaliteten hos den ursprungliga vävnaden från vilken de härleddes 11,12,13 . Även om etablerade blåscancercellinjer är lättillgängliga, relativt kostnadseffektiva, skalbara och enkla att manipulera, misslyckas in vitro-cellinjerna i stor utsträckning med att efterlikna spektrumet av olika genetiska och epigenetiska förändringar som observerats i klinisk blåscancer12,14 och alla etablerades och upprätthölls under 2D, vidhäftande odlingsförhållanden. Dessutom har cellinjer härledda från primära och metastatiska blåstumörer signifikant genetisk avvikelse från det ursprungliga tumörmaterialet. 8,15.
Ett alternativt tillvägagångssätt är att använda genetiskt konstruerade och cancerframkallande inducerade musmodeller. Men medan dessa modeller rekapitulerar några av de naturliga onkogena kaskaderna som är involverade i human neoplasi (granskad i refs 16,17,18), saknar de tumörheterogenitet, är dyra, representerar dåligt invasiv och metastatisk blåscancer och är inte livskraftiga för snabb läkemedelstestning eftersom tumörer kan ta många månader att utveckla 14,19 . Patient-härledda modeller av cancer (inklusive organoider, villkorligt omprogrammerad primärcellodling och xenotransplantat) ger ovärderliga möjligheter att förstå effekterna av läkemedelsbehandling före klinisk behandling20. Trots detta använder få grupper rutinmässigt dessa patient-proximala modeller på grund av begränsad tillgång till färsk primär patientvävnad och den omfattande optimering som krävs för att reproducerbart generera patient-härledda organoid (SUB) odlingsförhållanden. I en in vivo-miljö kan onkogena celler interagera och kommunicera med olika kompositioner av de omgivande beståndsdelarna, inklusive stromaceller, vävnadsinfiltrerande immunceller och matris12. På samma sätt, för PDF-filer som odlas i ett 3D-format, kan cell-/matriskomplexitet anpassas för att inkludera andra relevanta komponenter. PDO kan snabbt genereras och kan ofta passeras i stor utsträckning eller kryokonserveras för senare användning, trots att de har en begränsad livslängd 21,22,23. Farmakodynamik (dvs. svar på ett läkemedel) kan utvärderas med hjälp av flera avläsningar, inklusive organoidviabilitet och morfologi, och karakterisering av immunohistokemiska mål eller transkriptionsförändringar.
Här beskrivs procedurerna för etablering av blåscancerorganoider från patientmaterial som samlats in från transuretral resektion av blåstumör (TURBT) eller kirurgiskt avlägsnande av blåsan (radikal cystektomi). Metoden för att generera PDF-filer illustreras med hjälp av lättillgängliga våta laboratoriematerial och verktyg. Endpoints inkluderar förändringar i cellmorfologiska egenskaper och livskraft. Dessa mättes med hjälp av fluorescensmikroskopi, in vitro-viabilitetsanalyser (metabolisk och cellmembranintegritet) och histopatologisk analys. Figur 1 visar arbetsflödet för att fastställa humana blåscancer-PDOs från kliniskt material som erhållits under elektiv kirurgi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.2 mL cryogenic vial</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9661-500EA</td>
			<td>polypropylene single-use tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Collagenase/ Hyaluronidase</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#181;M reversible strainer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#27250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37&#176;C water bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% (w/w) ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well ultra low attachment plate (Black)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3474-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>BioScientific</td>
			<td>2939</td>
			<td>Prevents the growth-inhibitory effects of TGF-&#946;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK lysis buffer</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adDMEM/F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12634028</td>
			<td>Base medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-free recombinant EGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>518179</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter (TC20)</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 additive</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Increases sphere-forming efficiency</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Counting Slides</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>1450015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP022628188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoStor CS10</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07930</td>
			<td>Cell freezing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II, powder</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>17105041</td>
			<td>To enzymatically disrupt Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>#07900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry and wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Esky</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Farmdyne (Iodine 16g/L)</td>
			<td>Ecolab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td>Histological tissue fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax (L-alanine-L-glutamine)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Source of nitrogen for the synthesis of proteins, nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>All-purpose buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>ProSciTech</td>
			<td>RCH44-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-26-25</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-2</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B-50</td>
			<td>Growth factor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (Growth Factor Reduced (GFR), phenol red-free, LDEV free)</td>
			<td>In Vitro Technologies</td>
			<td>356231</td>
			<td>Basement membrane extract (BME)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty freezing container</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>cell freezing container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine (NAC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7250</td>
			<td>Anti-oxidant required to protect against ROS-induced cytotoxicity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100G</td>
			<td>SIRT-1 inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NikonTs2U inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MFA510BB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements Advanced Research</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noggin conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>BMP inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetboy acu 2</td>
			<td>Integra</td>
			<td>155000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes (p20, p100, p1000) with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>ant-pm2</td>
			<td>Combination of antibacterial and antifungal compounds to protect cell cultures from contaminations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prostaglandin E2 (PGE2)</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2296</td>
			<td>support proliferation of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary tube mixer</td>
			<td>Ratek</td>
			<td>RSM7DC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-spondin 1 conditioned media</td>
			<td>In-house</td>
			<td></td>
			<td>WNT signalling regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1077-25mg</td>
			<td>Selective p38 MAP kinase inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Livingstone</td>
			<td>WBLDHDL03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels, #11 blade</td>
			<td>Medical and Surgical Requisites</td>
			<td>EU-211-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes (5, 10, 25 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Specimen Waste Bags</td>
			<td>Medical Search</td>
			<td>SU09125X16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine specimen jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>Jomar Bioscience</td>
			<td>s1049-10mg</td>
			<td>Selective ROCK inhibitor. Increases survival of dissociated epithelial cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of bladder cancer organoids as precision medicine tools

Nuvarande in vitro-terapeutiska testplattformar saknar relevans för tumörpatologiologi, som vanligtvis använder cancercellinjer etablerade som tvådimensionella (2D) kulturer på vävnadsodlingsplast. Det finns ett kritiskt behov av mer representativa modeller av tumörkomplexitet som exakt kan förutsäga terapeutiskt svar och känslighet. Utvecklingen av tredimensionell (3D) ex vivo-odling av patient-härledda organoider (PDO), härledda från färska tumörvävnader, syftar till att ta itu med dessa brister. Organoidkulturer kan användas som tumörsurrogat parallellt med rutinmässig klinisk hantering för att informera terapeutiska beslut genom att identifiera potentiella effektiva ingrepp och indikera terapier som kan vara meningslösa. Här syftar denna procedur till att beskriva strategier och ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för att upprätta PDO: er för blåscancer från färsk, livskraftig klinisk vävnad. Våra väletablerade, optimerade protokoll är praktiska för att sätta upp 3D-kulturer för experiment med begränsat och varierat utgångsmaterial direkt från patienter eller patienthärledd xenograft (PDX) tumörmaterial. Denna procedur kan också användas av de flesta laboratorier utrustade med standard vävnadsodlingsutrustning. Organoiderna som genereras med hjälp av detta protokoll kan användas som ex vivo-surrogat för att förstå både de molekylära mekanismerna som ligger till grund för urologisk cancerpatologi och för att utvärdera behandlingar för att informera klinisk hantering.

3D-organoider etablerades framgångsrikt från humana blåscancerpatienter TURBT och cystektomivävnader. Kortfattat belyser denna teknik en snabb bildning av 3D-multicellulära strukturer som är både livskraftiga och lämpliga för andra slutpunktsanalyser såsom histologisk utvärdering, molekylär karakterisering (genom immunohistokemi eller kvantitativ realtids-PCR) och läkemedelsscreening. Under proceduren (figur 1) kunde de olika eluaterna under våra filtreringsfaser (<strong class...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools at JoVE.com

Culture of Bladder Cancer Organoids as Precision Medicine Tools

Patient-härledda organoider (PDO) är ett kraftfullt verktyg i translationell cancerforskning, vilket återspeglar både den genetiska och fenotypiska heterogeniteten hos sjukdomen och svaret på personliga anti-cancerterapier. Här beskrivs ett konsoliderat protokoll för att generera humana primära blåscancer-SUB som förberedelse för utvärdering av fenotypiska analyser och läkemedelssvar.

Kultur av blåscancerorganoider som precisionsmedicinska verktyg

Current in vitro therapeutic testing platforms lack relevance to tumor pathophysiology, typically employing cancer cell lines established as ...

Denna metod är betydelsefull eftersom patient-härledda organoider ger ett snabbt och kraftfullt verktyg för att studera urologiska cancerformer eftersom de ofta efterliknar den genetiska och fenotypiska heterogeniteten hos denna multispektra sjukdom. Organoider kan isoleras från en begränsad mängd patientbiopsimaterial och kan snabbt expanderas för nedströms analys. Organoiderna som genereras med hjälp av detta protokoll kan användas både som modeller för att hjälpa oss att förstå den cellulära och molekylära grunden för urologiska cancerformer och som precisionsmedicinska verktyg för att låta oss förutsäga vilka behandlingar och enskilda patienter cancer kan svara på.Börja med att samla ett nytt makroskopiskt livskraftigt tumörprov från operationen och se till att provet är nedsänkt i transportmedium i ett sterilt 50 ml koniskt rör eller urinprovburk under transitering. Registrera provuppgifter inklusive vävnadsvikt, provbeskrivning och detaljer om eventuella blod- och urinprover på patientprovbehandlingsbladet. Byt försiktigt ut transportmediet med 10 ml basala medier och låt tumörvävnaden sedimentera genom tyngdkraften.Därefter, med hjälp av pincett, ta bort tumörvävnaden och placera den i en steril 90 millimeter petriskål. Registrera vävnadens vikt i gram eller milligram på det kliniska provbehandlingsarket och dissektionsnätet. Använd sedan sterila pincett i ett engångsskalpelellblad monterat på ett skalpellhandtag, ta bort den icke-cancerösa vävnaden och makroskopiskt synliga nekrotiska regioner.Tvätta tumörbitarna en eller två gånger med kall DPBS, samla sedan och överför dem till en ny steril 90 millimeter petriskål. Ta ett fotografi, rita ett vävnadsdiagram och planera vävnadsdissektionen på ett kliniskt bearbetningsnät. För histopatologisk analys, placera cirka 50 milligram av tumörvävnaden i en märkt engångsplasthistologikassett.Sänk sedan ner histologikassetten i en behållare med 5X till 10X volym av 10% neutralt buffrat formalin och inkubera över natten. Följande dag, ersätt formalin med 70% etanol för lagring vid fyra grader Celsius tills vävnaden kan bearbetas. För molekylär analys, snäpp frys minst en tumörbit i en RNase, DNasfri 1,5 ml kryovial med flytande kväve och förvara vid minus 80 grader Celsius.Därefter dispensera fem milliliter organoidmedium i 90 millimeter petriskålen som innehåller de återstående tumörbitarna och mekaniskt hacka vävnaden så fin som möjligt. med ett sterilt skalpellblad nummer 10. Överför den finmalna vävnaden till ett 50 ml koniskt rör och tillsätt fyra milliliter organoidmedium, en milliliter 10X kollagenas / hyaluronidas och 0,1 milligram per milliliter DNasE I för att undvika cellklumpning.Inkubera den malet tumörvävnaden i enzymlösning i en till två timmar på en orbital shaker eller rotator i en inkubator för att dissociera fragment i en cellsuspension och bryta ner kollagener. Stoppa sedan matsmältningen genom att tillsätta dubbelt så mycket basalmedium till provet. Centrifugera provet, aspirera och kassera supernatanten.Därefter, för att lysera förorenande röda blodkroppar, resuspendera pelleten i fem milliliter ammoniumkloridkaliumbuffert och inkubera röret vid rumstemperatur i tre minuter eller tills fullständig lys av de röda blodkropparna ses. Tillsätt sedan 20 ml basalmedium i röret. Centrifugera igen och aspirera supernatanten.Vid detta steg placerar du en 10 ml alikvot av 2X och 1X organoidmedium i ett 37 grader Celsius vattenbad för att värma. Filtrera provet först genom en förvåt reversibel sil på 100 mikron i ett nytt 50 ml rör för att avlägsna stort olösligt material. Filtrera sedan eluten genom en förvätt reversibel 37 mikron sil för att samla enskilda celler i små kluster för isolering av enstaka celler och immunceller.Vänd sedan 37 mikron silen och tillsätt 10 ml basalmedia för att samla små och måttliga kluster. Fyll på vart och ett av dessa nya 50 ml rör med DPBS till 40 ml, centrifugera sedan suspensionen och kassera supernatanten. Tillsätt sedan 10 ml basalmedia till röret som innehåller de enskilda cellerna och räkna cellerna med trypanblått uteslutningsfärgämne i en automatiserad cellräknare.Bestäm cellnummer och livskraft hos celler. Centrifugera det återstående provet och ersätt mediet med cellfrysningslösning eller basalmedia innehållande 10% fetalt bovint serum 1% penicillin och streptomycin och 10% DMSO, placera sedan proverna i 1,5 ml kryovialer, förvara dem i en självfrysande behållare och överför omedelbart behållarna till en minus 80 grader Celsius frys. Nästa dag, överför kryovialerna till kryogen vätska eller luftfaslagring för långvarig lagring.Därefter resuspend de uppsamlade små och måttliga klusterna med 500 mikroliter förvärmt 2X organoidmedium. Tillsätt sedan BME till cellerna med iskalla P-1000 sterila filterpipettspetsar och blanda försiktigt. Pipettera snabbt och noggrant 100 mikroliter av de rekonstituerade cellerna BME-blandning till brunnar med en extremt låg fastsättning, platt botten 96-brunnsplatta och placera plattan i en inkubator i 20 till 30 minuter för att stelna.Efter inkubation tillsätt organoidmedium ovanpå BME-cellsuspensionen i ett ett till två-förhållande beroende på den empiriskt bedömda volymen och placera plattan i en inkubator i 20 minuter för att balansera. Efter inkubation, ta bort plattan från inkubatorn och montera den på en provhållare på scenen i ett mikroskop för att bedöma organoider visuellt under faskontrast eller ljusa fältinställningar. Fyll på mediet varannan till var tredje dag med 50 mikroliter förvärmt organoidmedium för att fylla på utarmade tillväxtfaktorer och total volym.Hämta timelapse-seriebilderna på dag 1, 2 och 3 samt 5, 7 och 10 innan de passerar. Två timmars matsmältning av blåscancervävnad med kommersiellt tillgänglig kollagenas / hyaluronidas och DNasE I leder till tillräcklig matsmältning av 0,5 till 1 kubikmillimeter bitar av mer komplex cystektomi biopsivävnad, inklusive de neoplastiska cellerna i lamina propria och muskelskikt i urinblåsan. Större fragment efter matsmältningen är lämpliga för odling och standardvävnadsodlingsplattor av alla storlekar för att isolera nya tvådimensionella kulturer.Organoider som genereras av denna procedur genomgår dynamisk självmontering, inklusive faser av aggregering, komprimering och slutlig bildning av snäva cellulära strukturer. Histologiskt rekapitulerar dessa strukturer den ursprungliga patienttumören. Organoider som genereras i denna procedur är lämpliga för många ändamål, inklusive ytterligare histopatologisk karakterisering, biobankning och läkemedelseffekttestning.Efter generering av organoider kan ytterligare metoder användas för att profilera dessa tumörer, inklusive rollen som anti-cancerterapier, metabolisk profilering eller transkriptionsprofilering. Inom denna 3D-ram ger dessa ytterligare metoder kraftfull inblick i blåscancerbiologi. Denna metod var en viktig grund för studier som undersökte immunoonkologi och cellulär metabolism.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

En Murin Orthotopic blåstumör modell och Tumör Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-D cellodlingssystem för att studera Invasion och utvärdera Therapeutics i Cancer i urinblåsan

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Magnetic Resonance Imaging Assessment of Carcinogen-induced Murine Bladder Tumors

Magnetisk resonanstomografi bedömning av cancerframkallande-inducerad murina urinblåsan tumörer

Murine bladder tumor models are critical for the evaluation of new therapeutic options. Bladder tumors induced with the N-butyl-N-(4-hydroxybutyl) ...

Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses

Prostata Organoid kulturer som verktyg för att översätta genotyper och Mutationella profiler till farmakologiska svar

Presented here is a protocol to study pharmacodynamics, stem cell potential, and cancer differentiation in prostate epithelial organoids. Prostate ...

Culture, Manipulation, and Orthotopic Transplantation of Mouse Bladder Tumor Organoids

Kultur, manipulation och orthotopic transplantation av mus blåsa norgan organoider

The development of advanced tumor models has long been encouraged because current cancer models have shown limitations such as lack of three-dimensional ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Ortopisk transplantation av brösttumörer som prekliniska modeller för bröstcancer

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

Modeling Oral-Esophageal Squamous Cell Carcinoma in 3D Organoids

Modellering av oral-esofageal skivepitelcancer i 3D-organoider

Esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) is prevalent worldwide, accounting for 90% of all esophageal cancer cases each year, and is the deadliest of all ...

Establishment and Culture of Patient-Derived Breast Organoids

Etablering och odling av patient-härledda bröstorganoider

Breast cancer is a complex disease that has been classified into several different histological and molecular subtypes. Patient-derived breast tumor ...

Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Etablering och karakterisering av patient-härledda xenograftmodeller av anaplastisk sköldkörtelcancer och skivepitelcancer i huvud och hals

Patient-derived xenograft (PDX) models faithfully preserve the histological and genetic characteristics of the primary tumor and maintain its ...

Optimering av HCC-organoidbildning för målmolekylidentifiering och läkemedelsutveckling

Development and Optimization of A Human Hepatocellular Carcinoma Patient-Derived Organoid Model for Potential Target Identification and Drug Discovery

Författare i fokus: Undersöker levercancerpatogenes med hjälp av patienthärledda organoider 

Utveckling och optimering av en patienthärledd organoidmodell för humant hepatocellulärt karcinom för potentiell målidentifiering och läkemedelsupptäckt

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a highly prevalent and lethal tumor worldwide and its late discovery and lack of effective specific therapeutic agents ...